Esaminando Assemblea Proteasome con ricombinante archeali proteasomi e nondenaturing PAGINA: il caso di un approccio combinato
Summary
Questo protocollo utilizza sia coexpression subunità e postlysis subunità miscelazione per un esame più approfondito di assemblaggio proteasoma ricombinante.
Abstract
Proteasomi si trovano in tutti i campi della vita. Essi forniscono la principale via di degradazione delle proteine intracellulari negli eucarioti, anche se il loro montaggio non è completamente noto. Tutti i proteasomi contengono una particella strutturalmente conservato nucleo (CP), o 20S proteasoma, contenente due anelli subunità beta heptameric a sandwich tra due anelli α subunità heptameric. Archaeal 20S proteasomi sono compositivo semplice rispetto alle loro controparti eucariotiche, ma entrambi condividono un meccanismo di montaggio comune. Di conseguenza, archaeal 20S proteasomi continuano ad essere modelli importanti per il montaggio del proteasoma eucariotica. In particolare, l'espressione ricombinante della 20S archeali proteasomi accoppiato con nondenaturing gel di poliacrilammide (PAGE) ha prodotto molti importanti intuizioni proteasoma biogenesi. Qui, si discute un mezzo per migliorare la solita strategia di coexpression di α proteasoma archeali e subunità beta prima nondenaturing PAGINA. Abbiamo dimostrato che, anche se rapido ed efficace, un approccio coexpression solo può mancare intermedi chiave di montaggio. Nel caso del proteasoma, coexpression potrebbe non consentire il rilevamento del semi-proteasoma, una contenente una α-anello completo intermedio e una β-anello completo. Tuttavia, questo intermedio è facilmente rilevata tramite lisato di miscelazione. Si suggerisce che la combinazione coexpression con lisato di miscelazione produce un approccio più completo per l'analisi di assemblaggio, ma rimane non intensiva del lavoro. Questo approccio può essere utile per lo studio di altri complessi multiproteici ricombinanti.
Introduction
Complessi multiproteici svolgono numerose attività cellulari critiche 1. Per molti di questi complessi, molto di più si sa sulla loro struttura e la funzione di circa il loro montaggio 2,3. Il proteasoma è un tale complesso e si trova in tutti i campi della vita. In eucarioti, questa macchina molecolare è alla base del sistema Proteasome / ubiquitina (UPS) e fornisce la principale via di degradazione delle proteine intracellulari 4. Il proteasoma eucarioti (indicato come il proteasoma 26S) è composto da due grandi gruppi di sub: un proteasoma 20S, o Core Particle (CP) 5, che può essere limitato a una o entrambe le estremità da una particella regolamentazione 19S (RP) 6.
Il proteasoma 20S è un grande proteasi compartimenti stagni. La sua struttura quaternaria è assolutamente conservata in tutti i domini della vita e consiste in una pila di quattro anelli di sette membri contenente due tipi di subunità strutturalmente correlati, α; e ß 5,7,8. Negli eucarioti, i due anelli esterni sono ciascuna costituite da sette subunità alfa distinti e due anelli interni sono ciascuna costituite da sette subunità beta distinti; attività proteolitica risiede entro tre delle subunità beta. Per contro, gli anelli di CP archaea e batteri sono generalmente costituiti da un solo tipo di α e un tipo di subunità β. Proteasomi archaeal hanno fornito un sistema importante modello per lo studio di montaggio proteasoma sia per la loro semplicità compositiva e la loro condivisione di un meccanismo di montaggio comune con le loro controparti eucariotiche 9-13. In breve, subunità alfa assemblano in anelli alfa prima, che servono da impalcatura su cui beta subunità assemblare. I risultanti mezze proteasomi (α β 7 7) dimerizzano, dando luogo ad assemblare completamente CP (α β 7 7 β α 7 7). Durante dimerizzazione, i propeptidi presenti su subunità betasono autocatalytically rimossi, esponendo i catalitici threonines N-terminale. L'uso dei proteasomi archeali per modellare il montaggio prende frequentemente vantaggio della produzione di proteine ricombinanti proteasoma archeali in Escherichia coli. Questo è un approccio interessante perché consente subunità essere prodotte in varie combinazioni, sia come WT e versioni mutanti, in un organismo ospite che non produce i propri proteasomi.
Monitorare l'assemblaggio di complessi multi-proteina richiede biochimicamente un qualche tipo di metodo di frazionamento che separa i complessi completamente assemblati da intermedi di assemblaggio e precursori. Grazie alla sua capacità di risoluzione superiore, nondenaturing SDS-PAGE (PAGINA) ha dimostrato di essere particolarmente utile nel frazionamento di varie grandi complessi multiproteici 14-17. La combinazione di produzione proteasoma archaeal ricombinante e PAGE nondenaturing è diventato un approccio potente dissecting assemblaggio proteasoma 9,11,12,18. Tuttavia, il metodo usuale con cui questo approccio viene applicato (es. Tramite la coespressione ricombinante di alfa e beta subunità) ha un importante inconveniente. Le reazioni di montaggio sono cooperativa e fortemente dipendente dalla concentrazione 3. Dato che la concentrazione di proteine all'interno delle cellule è molto alta 19, a causa di effetti di volume escluso, reazioni di assemblaggio siano effettuati rapidamente in vivo. Quindi è possibile perdere importanti intermedi di montaggio quando alfa e beta subunità sono coexpressed.
Qui, sosteniamo un approccio combinato nello studio di assemblaggio proteasoma usando ricombinanti subunità del proteasoma archeali. In questo approccio, entrambi i metodi di miscelazione coespressione e lisato sono impiegati. Il primo permette per l'analisi rapida di assemblaggio, perché coexpression è meno laborioso. Quest'ultimo dipende espressione separata di alfa e beta subunità, seguita da miscelazione. Anche se questo requires un po 'più sforzo che coexpression, è più che compensata dalla capacità di individuare prodotti intermedi che sono mancati durante coexpression. Insieme, questi due metodi in grado di fornire un quadro più completo di montaggio proteasoma.
Protocol
Representative Results
Discussion
Dimostriamo il vantaggio di un approccio combinato di analizzare il montaggio proteasoma da nondenaturing pagina utilizzando proteasomi archeali ricombinanti. Il metodo usuale 9,11 di coexpression batterica subunità del proteasoma permette una rapida analisi, ma non può rivelare intermedi chiave di montaggio. Vi proponiamo la combinazione coexpression con lisato di miscelazione per sviluppare un quadro più ampio di eventi di assemblaggio.
Il vantaggio di questo approccio combin…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Questo lavoro è stato sostenuto in parte da una ricerca di sostegno i fondi delle sovvenzioni (RSFG) da Indiana University-Purdue University, Indianapolis, e in parte da un premio dalla American Heart Association 14GRNT20390154, di ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
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