Denne protokollen bruker både subenhet koekspresjon og postlysis subenheten blande for en mer grundig undersøkelse av rekombinant proteasome montering.
Proteasomer finnes i alle områder av livet. De gir den viktigste ruten for intracellulær protein nedbrytning i eukaryoter, selv om deres forsamlingen ikke helt forstått. Alle proteasomer inneholde en strukturelt konservert kjernepartikkel (CP), eller 20S-proteosomet inneholder to heptameric p-subenhet-ringer klemt mellom to heptameric α subenhet ringer. Archaeal 20S proteasomer er sammensetnings enklere i forhold til sine eukaryote kolleger, men de begge deler en felles montering mekanisme. Derfor archaeal 20S proteasomer fortsette å være viktige modeller for eukaryote proteasome montering. Nærmere bestemt har rekombinant uttrykk for archaeal 20S proteasomer kombinert med nondenaturing polyakrylamidgelelektroforese (PAGE) ga mange viktige innsikt i proteasome biogenesis. Her diskuterer vi et middel til å forbedre den vanlige strategien for koekspresjon av archaeal proteasomer α og p-subenheter før nondenaturing SIDE. Vi viser at selv om rask og effektiv, kan en koekspresjon tilnærming alene savner sentrale monteringsmellomprodukter. I tilfelle av proteosomet, kan koekspresjon ikke tillate påvisning av den halv-proteosomet, et mellomprodukt inneholdende en komplett α-ring og en fullstendig β-ring. Men dette mellomproduktet kan lett detekteres via lysat blanding. Vi foreslår at å kombinere koekspresjon med lysat blanding gir en tilnærming som er mer grundig i å analysere montering, men fortsatt arbeid nonintensive. Denne fremgangsmåten kan være nyttig for studier av andre rekombinante multiprotein komplekser.
Multiprotein komplekser utføre en rekke kritiske cellulære aktiviteter 1. For mange av disse kompleksene, er mye mer kjent om deres struktur og funksjon enn om deres montering 2,3. Proteasome er en slik kompleks og finnes i alle områder av livet. I eukaryoter, er denne molekylære maskinen i kjernen av ubiquitin / Proteasome system (UPS) og gir den store rute for intracellulær proteindegradering 4. Den eukaryote proteasomet (også omtalt som den 26S-proteasomet) består av to store sub-sammenstillinger: en 20S-proteosomet, eller Core Particle (CP) 5, som kan bli avkortet på den ene eller begge ender av en 19S Regulatory partikkel (RP) 6.
Den 20S proteasomet er et stort compartmentalized protease. Dets kvaternære struktur er fullstendig konservert i alle områder av liv, og består av en stabel av fire syv-leddede ringer inneholdende to typer av strukturelt beslektede subenheter, α; og p 5,7,8. I eukaryoter, er de to ytre ringer hver består av syv forskjellige a-subenheter og to indre ringer er hver består av syv forskjellige p-underenheter; proteolytisk aktivitet ligger innenfor de tre p-underenheter. I motsetning til dette blir de CP ringer av archaea og bakterier vanligvis består av bare en type α og en type β subenheten. Archaeal proteasomer har gitt en viktig modellsystem for å studere proteasome montering både på grunn av sin kompositoriske enkelhet og deres deler en felles montering mekanisme med sine eukaryote kolleger 9-13. I korte trekk, a-subenheter montere inn a ringer først, som tjener som et stillas hvorpå p-subenheter montere. De resulterende halv proteasomer (α 7 β 7) dimerisere, gir opphav til ferdig montert CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerization, propeptidene presentere på p-subenheterer autocatalytically fjernet, utsette de katalytiske N-terminale treoniner. Bruken av archaeal proteasomer for å modellere montering finner ofte fordel av produksjon av rekombinante archaeal proteasomer proteiner i Escherichia coli. Dette er en verdig tilnærming fordi det muliggjør at underenheter som skal produseres i forskjellige kombinasjoner, som både WT og muterte versjoner, i en vertsorganisme som ikke produserer sin egen proteasomer.
Overvåking av sammenstillingen av multiproteinkomplekser biokjemisk krever noen form for fraksjoneringsmetode som skiller ferdig montert komplekser fra monteringsmellomprodukter og forløpere. På grunn av sin overlegne løse kapasitet, nondenaturing polyakrylamid-gelelektroforese (PAGE) har vist seg å være spesielt nyttige ved fraksjonering av forskjellige store multiprotein komplekser 14-17. Kombinasjonen av rekombinant archaeal proteasome produksjon og nondenaturing siden har blitt en kraftig tilnærming i dissecting proteasome montering 9,11,12,18. Men den vanlige metode ved hvilken denne metoden anvendes (f.eks. Via det rekombinante koekspresjon av a- og p-subenheter) har en viktig ulempe. Monterings reaksjoner er samarbeidsvillig og sterkt konsentrasjonsavhengig tre. Gitt at proteinkonsentrasjonen inne i cellene er meget høy 19, på grunn av utelukkede volumeffekter, montering reaksjoner forløper hurtig in vivo. Derfor er det mulig å gå glipp av viktige monteringsmellom når a og p subenheter er koekspresjon.
Her argumenterer vi for en kombinert tilnærming i studiet av proteasome settet med rekombinante archaeal proteasomer subenheter. I denne fremgangsmåten, blir begge koekspresjon og lysat blandemetoder anvendes. Den tidligere muliggjør rask analyse av forsamlingen fordi koekspresjon er mindre arbeidskrevende. Sistnevnte er avhengig av egen ekspresjon av a og p-underenheter, etterfulgt av blanding. Selv om dette krav som stillesres litt mer innsats enn koekspresjon, er det mer enn kompensert for ved evnen til å oppdage mellom som er savnet under koekspresjon. Til sammen kan disse to metodene gir et mer fullstendig bilde av proteasome montering.
Vi viser til fordel for en kombinert tilnærming til å analysere proteasome montering av nondenaturing PAGE ved anvendelse av rekombinante archaeal proteasomer. Den vanlige metoden for bakteriell 9,11 koekspresjon av proteasomer underenhetene gjør det mulig for hurtig analyse, men kan ikke avsløre nøkkelmontasjemellomprodukter. Vi foreslår å kombinere koekspresjon med lysat blanding for å utvikle et bredere bilde av monterings hendelser.
Fordelen med denne kombinerte fremga…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet delvis av en forsknings Support Funds Grant (RSFG) fra Indiana University-Purdue University, Indianapolis, og delvis av en pris fra American Heart Association 14GRNT20390154, til ARK
Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
ATP | Sigma | A7699 | |
BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
DNaseI | Sigma | DN25 | |
Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
Glycerol | Sigma | 49767 | |
Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
HEPES | US Biologicals | H2010 | |
HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
Lysozyme | Sigma | L6876 | |
MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
TEMED | Sigma | T7024 | |
Tris | US Biologicals | T8600 | |
Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
Yeast extract | Bacto BD | 212720 |