Undersöka Proteasome Montering med rekombinant archaeal proteasomerna och Nondenaturing SIDA: Fallet för ett kombinerat tillvägagångssätt
Summary
Detta protokoll använder både subenhet samuttryck och postlysis subenhet blandning i en mer grundlig undersökning av rekombinant proteasom enheten.
Abstract
Proteasomer finns i alla områden i livet. De ger den huvudsakliga vägen för intracellulär proteinnedbrytning i eukaryoter, även om deras montering inte är fullständigt förstådd. Alla proteasomer innehåller en strukturellt konserverad kärnpartikel (CP), eller 20S proteasom, innehållande två heptameric p-subenheten ringar inklämt mellan två heptameric α subenhet ringar. Archaeal 20S proteasomer är sammansättnings enklare jämfört med sina eukaryota motsvarigheter, men de båda har en gemensam monteringsmekanism. Följaktligen archaeal 20S proteasomer fortsätter att vara viktiga modeller för eukaryot proteasom montering. Specifikt har rekombinant uttryck av archaeal 20S proteasomer tillsammans med nondenaturing polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) gav många viktiga insikter proteasom biogenes. Här diskuterar vi ett sätt att förbättra den vanliga strategin för samuttryck av archaeal proteasom α och p subenheter före nondenaturing PAGE. Vi visar att även en snabb och effektiv, kan enbart en samexpression tillvägagångssätt missar viktiga monteringsmellan. I fallet med proteasomen kan samuttryck inte tillåta detektering av den halv-proteasom, en mellanprodukt innehållande en komplett α-ringen och en komplett β-ring. Men detta mellan lätt upptäckas via lysat blandning. Vi föreslår att kombinera samuttryck med lysat blandning ger ett tillvägagångssätt som är mer noggrann i att analysera montering, men förblir arbets nonintensive. Detta tillvägagångssätt kan vara användbart för studier av andra rekombinanta multiproteinkomplex.
Introduction
Multiproteinkomplex utför många kritiska cellulära aktiviteter 1. För många av dessa komplex, mycket mer är känt om deras struktur och funktion än om deras montering 2,3. Proteasomet är ett sådant komplex och finns i alla livsområden. I eukaryoter, är detta molekylär maskin i centrum av ubiquitin / proteasomsystemet (UPS) och ger den huvudsakliga vägen av intracellulär proteinnedbrytning 4. Den eukaryota proteasom (kallad 26S proteasomen) består av två stora underenheterna: a 20S proteasom eller kärnpartikel (CP) 5, som kan förslutas på en eller båda ändarna med en 19S Regulatory partikel (RP) 6.
20S proteasom är ett stort fack proteas. Dess kvatemära strukturen är helt konserverad över alla livsområden och består av en stapel av fyra sju-ledade ringar innehållande två typer av strukturellt besläktade subenheter, α; och p-5,7,8. I eukaryoter, är de två yttre ringarna var och en består av sju distinkta a-subenheter och de två inre ringarna är var och en består av sju distinkta p-subenheter; proteolytisk aktivitet ligger inom tre av p-subenheter. Däremot är de CP ringar av arkéer och bakterier vanligtvis består av endast en typ av α och en typ av β-subenheten. Archaeal proteasomer har gett ett viktigt modellsystem för att studera proteasom montering på grund av både deras sammansättning enkelhet och deras delar en gemensam monteringsmekanism med sina eukaryota motsvarigheter 9-13. I korthet, a-subenheter montera in a ringar första, som tjänar som en byggnadsställning på vilken p-subenheter montera. De resulterande halv proteasomer (α 7 β 7) dimeriserar, vilket ger upphov till fullt monterade CP (α 7 β 7 β 7 α 7). Under dimerisering, propeptiderna presenterar på p-subenheterär autokatalytiskt bort, utsätta de katalytiska N-terminal treoniner. Användningen av archaeal proteasomer för att modellera sammansättningen har ofta nytta av produktionen av rekombinanta archaeal proteasom proteiner i Escherichia coli. Detta är ett värdefullt tillvägagångssätt eftersom det gör det möjligt för subenheter som skall produceras i olika kombinationer, som både WT och muterade versioner, i en värdorganism som inte producerar sina egna proteasomer.
Övervakning av montering av multiproteinkomplex biokemiskt kräver någon form av fraktioneringsmetod som separerar färdigmonterade komplex från monterings intermediärer och prekursorer. På grund av dess överlägsna upplösningskapacitet, nondenaturing polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) har visat sig vara speciellt användbar vid fraktionering av olika stora multiproteinkomplex 14-17. Kombinationen av rekombinant archaeal proteasom produktion och nondenaturing blivit en kraftfull metod i dissecting proteasom aggregatet 9,11,12,18. Men den vanliga metoden genom vilken denna metod används (dvs.. Via rekombinanta samuttryck av a- och P-subenheter) har en viktig nackdel. Monterings reaktioner är samarbetsvillig och starkt koncentrationsberoende tre. Med tanke på att proteinkoncentrationen inuti celler är mycket hög 19, på grund av uteslutna volymeffekter, monterings reaktioner fortskrider snabbt in vivo. Därför är det möjligt att missa viktiga monteringsmellan när a- och p-subenheter samuttrycks.
Här argumenterar vi för ett kombinerat tillvägagångssätt i studien av proteasom montering med rekombinanta archaeal proteasom subenheter. I detta tillvägagångssätt, är båda samuttryck och lysat blandningsmetoder användes. Den förra möjliggör snabb analys av montering eftersom samuttryck är mindre arbetskrävande. Det senare beror på separat uttryck av a- och P-subenheter, följt av blandning. Även om detta behöver utförasres lite mer ansträngning än samuttryck, är det mer än kompenseras av förmågan att upptäcka mellan som missats under samexpression. Tillsammans kan dessa två metoder ge en mer fullständig bild av proteasom enheten.
Protocol
Representative Results
Discussion
Vi visar fördelen med en kombinerad metod för att analysera proteasom enheten genom nondenaturing PAGE med användning av rekombinanta archaeal proteasomer. Den vanliga metoden 9,11 av bakteriell samuttryck av proteasom subenheter möjliggör snabb analys men kan inte avslöja viktiga monteringsmellan. Vi föreslår att kombinera samuttryck med lysat blandning för att utveckla en bredare bild av monterings händelser.
Fördelen med denna kombinerade tillvägagångssätt är att…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Detta arbete stöddes delvis av en forsknings Support Funds Grant (RSFG) från Indiana University-Purdue University, Indianapolis, och delvis av en utmärkelse från American Heart Association 14GRNT20390154 till ARK
Materials
| Acrylamide (40%) solution | Biorad | 1610104 | Unpolymerized acrylamide is a neurotoxin. Wear proper protective equipment |
| Amicon ultra 0.5ml centrifugal filters | EMDMillipore | UFC501024 | |
| Ammonium persulfate | Sigma | A3678 | |
| ATP | Sigma | A7699 | |
| BCA assay kit | Pierce | 23225 | |
| Bisacrylamide (2%) solution | Biorad | 1610142 | |
| Bromophenol blue | Sigma | B8026 | |
| DNaseI | Sigma | DN25 | |
| Dithiothreitol (DTT) | Thermo Fisher | BP172 | |
| E.coli BL21 competent cells | EMD Millipore | 69450 | |
| GelCode Blue | Thermo Fisher | 24592 | Colloidal coomassie stain reagent for gels |
| Gel doc EZ system | Biorad | 1708270 | Gel documentation system |
| Gel releasers | Biorad | 1653320 | Wedge shaped plastic used to separate gel plates; useful for spreading liquid. |
| Glass rod | Thermo Fisher | 11-380B | |
| Glycerol | Sigma | 49767 | |
| Glycine | Thermo Fisher | BP3865 | |
| Hamilton syringe | Thermo Fisher | 14-813-38 | Glass syringe for loading gels |
| HEPES | US Biologicals | H2010 | |
| HMW Native calibration kit | GE Healthcare | 170445-01 | High molecular weight protein standards |
| Hoefer SG30 | Thermo Fisher | 03-500-277 | Gradient maker |
| Imidazole | US Biologicals | 280671 | |
| IPTG | US Biologicals | I8500 | For induction of protein expression |
| Isopropanol | Thermo Fisher | BP26181 | |
| Kanamycin sulfate | US Biologicals | K0010 | |
| Lysozyme | Sigma | L6876 | |
| MgCl2 | Fluka analytical | 630680 | |
| Mini Protean Tetra Cell | Biorad | 1658002EDU | Gel electrophoresis apparatus |
| NaCl | Thermo Fisher | S640-3 | |
| NaOH | Thermo Fisher | S318-1 | |
| Pefabloc SC | Roche | 11429876001 | Protease inhibitor |
| pET42 | EMD Millipore | 70562 | Expression plasmid |
| Precision plus all blue standard | Biorad | 1610373 | Molecular protein standard for SDS-PAGE |
| Quickchange mutagenesis kit | Agilent technologies | 200521 | |
| Sodium dodecyl sulfate (SDS) | Thermo Fisher | BP166 | |
| Suc-LLVY-AMC | Enzo lifesciences | BML P802-0005 | Fluorogenic substrate |
| Talon Metal Affinity Resin | Clontech | 635502 | Immobilized-cobalt affinity resin |
| TEMED | Sigma | T7024 | |
| Tris | US Biologicals | T8600 | |
| Triton-X100 | Sigma | 93426 | |
| Tryptone | Bacto BD | 211699 | |
| UV sample tray | Biorad | 1708271 | For UV imaging of gels |
| Yeast extract | Bacto BD | 212720 |
References
- Wan, C., et al. Panorama of ancient metazoan macromolecular complexes. Nature. 525, 339-344 (2015).
- Marsh, J. A., Teichmann, S. A. Structure, dynamics, assembly, and evolution of protein complexes. Annu Rev Biochem. 84, 551-575 (2015).
- Williamson, J. R. Cooperativity in macromolecular assembly. Nat Chem Biol. 4, 458-465 (2008).
- Finley, D., Ulrich, H. D., Sommer, T., Kaiser, P. The ubiquitin-proteasome system of Saccharomyces cerevisiae. Génétique. 192, 319-360 (2012).
- Groll, M., et al. Structure of 20S proteasome from yeast at 2.4 A resolution. Nature. 386, 463-471 (1997).
- Lander, G. C., et al. Complete subunit architecture of the proteasome regulatory particle. Nature. 482, 186-191 (2012).
- Lowe, J., et al. Crystal structure of the 20S proteasome from the archaeon T. acidophilum at 3.4 A resolution. Science. 268, 533-539 (1995).
- Hu, G., et al. Structure of the Mycobacterium tuberculosis proteasome and mechanism of inhibition by a peptidyl boronate. Mol Microbiol. 59, 1417-1428 (2006).
- Zwickl, P., Kleinz, J., Baumeister, W. Critical elements in proteasome assembly. Nat Struct Biol. 1, 765-770 (1994).
- Groll, M., Brandstetter, H., Bartunik, H., Bourenkow, G., Huber, R. Investigations on the maturation and regulation of archaebacterial proteasomes. J Mol Biol. 327, 75-83 (2003).
- Frankenberg, R. J., Hsu, T. S., Yakota, H., Kim, R., Clark, D. S. Chemical denaturation and elevated folding temperatures are required for wild-type activity and stability of recombinant Methanococcus jannaschii 20S proteasome. Protein Sci. 10, 1887-1896 (2001).
- Maupin-Furlow, J. A., Aldrich, H. C., Ferry, J. G. Biochemical characterization of the 20S proteasome from the methanoarchaeon Methanosarcina thermophila. J Bacteriol. 180, 1480-1487 (1998).
- Maupin-Furlow, J. A., Ferry, J. G. A proteasome from the methanogenic archaeon Methanosarcina thermophila. J Biol Chem. 270, 28617-28622 (1995).
- Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. Blue native PAGE. Nat Protoc. 1, 418-428 (2006).
- Langer, T., Pfeifer, G., Martin, J., Baumeister, W., Hartl, F. U. Chaperonin-mediated protein folding: GroES binds to one end of the GroEL cylinder, which accommodates the protein substrate within its central cavity. EMBO J. 11, 4757-4765 (1992).
- McKenzie, M., Lazarou, M., Thorburn, D. R., Ryan, M. T. Analysis of mitochondrial subunit assembly into respiratory chain complexes using Blue Native polyacrylamide gel electrophoresis. Anal Biochem. 364, 128-137 (2007).
- Tomko, R. J., Hochstrasser, M. Incorporation of the Rpn12 subunit couples completion of proteasome regulatory particle lid assembly to lid-base joining. Mol Cell. 44, 907-917 (2011).
- Panfair, D., Ramamurthy, A., Kusmierczyk, A. R. Alpha-ring Independent Assembly of the 20S Proteasome. Sci Rep. 5, 13130 (2015).
- Zimmerman, S. B., Trach, S. O. Estimation of macromolecule concentrations and excluded volume effects for the cytoplasm of Escherichia coli. J Mol Biol. 222, 599-620 (1991).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Kim, R. Y., Hochstrasser, M. A conserved 20S proteasome assembly factor requires a C-terminal HbYX motif for proteasomal precursor binding. Nat Struct Mol Biol. 18, 622-629 (2011).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using bicinchoninic acid. Anal Biochem. 150, 76-85 (1985).
- Laemmli, U. K. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4. Nature. 227, 680-685 (1970).
- Chen, P., Hochstrasser, M. Autocatalytic subunit processing couples active site formation in the 20S proteasome to completion of assembly. Cell. 86, 961-972 (1996).
- Li, X., Kusmierczyk, A. R., Wong, P., Emili, A., Hochstrasser, M. beta-Subunit appendages promote 20S proteasome assembly by overcoming an Ump1-dependent checkpoint. EMBO J. 26, 2339-2349 (2007).
- Kusmierczyk, A. R., Kunjappu, M. J., Funakoshi, M., Hochstrasser, M. A multimeric assembly factor controls the formation of alternative 20S proteasomes. Nat Struct Mol Biol. 15, 237-244 (2008).
