En optimalisert protokoll for Elektro Mobility Skift Assay bruker infrarød Fluorescent Dye-merkede oligonukleotider
Summary
Vi beskriver her en optimalisert protokoll av fluorescerende Elektrofore Shift Mobility Analyser (FEMSA) med rensede SOX-2 proteiner sammen med infrarøde fluorescerende fargestoff-merkede DNA-prober som en case-studie for å takle en viktig biologisk spørsmålet.
Abstract
Elektro Shift Mobility Analyser (EMSA) er en instrumental verktøy for å karakterisere samspillet mellom proteiner og deres mål DNA-sekvenser. Radioaktivitet har vært den dominerende metoden for DNA-merking i EMSAs. Imidlertid har de siste fremskritt i fluorescerende fargestoffer og skannemetoder førte til at bruk av fluoriserende merking av DNA som et alternativ til radioaktivitet for fordelene ved enkel håndtering, spare tid, redusere kostnader og bedre sikkerhet. Vi har nylig brukt fluorescerende EMSA (FEMSA) for å ta opp en viktig biologisk spørsmålet. Vår FEMSA analysen gir mekanistisk innsikt i effekten av en missense mutasjon, G73E, i den svært konservert HMG transkripsjonsfaktor SOX-2 på olfactory neuron typen diversifisering. Vi fant at mutante SOX-2 G73E protein forandrer spesifikk DNA-bindingsaktivitet, og dermed forårsaker olfaktorisk nervecelle identitet transformasjon. Her presenterer vi en optimalisert og kostnadseffektiv steg-for-steg-protokollenfor FEMSA ved hjelp av infrarød fluorescerende fargestoff-merket oligonukleotider inneholder LIM-4 / SOX-2 tilstøtende målse og renset SOX-2 proteiner (WT og mutante SOX-2 G73E proteiner) som en biologisk eksempel.
Introduction
EMSAs blir brukt til å analysere interaksjoner mellom DNA og proteiner ved hjelp av naturlig polyakrylamidgel-elektroforese (PAGE) å løse en blanding av et protein av interesse og et merket DNA-probe som inneholdt potensielle måls av proteinet 1. En DNA-probe bundet med protein vil vandre langsommere sammenlignet med en fri DNA-probe, og er derfor retardert i sin vandring gjennom en polyakrylamid matriks. Radiomerking av DNA ved hjelp av 32P har vært den dominerende metoden for deteksjon i EMSAs. Selv om bruk av radiomerking i biokjemisk forskning har vært gunstig, er metoder for alternativ DNA merking med sammenlignbare følsomheten blir ansatt på grunn av helse- og sikkerhetsrisikoer forbundet med håndtering av radioaktivitet. Disse alternative metodene omfatter konjugering av DNA med biotin à eller digoxigenin (DIG) 3 (som begge er deretter oppdaget av kjemiluminescerende systemer), SYBR grønn farging av siden gels 4,eller direkte påvisning av DNA-fluorescerende fargestoff konjugater ved å skanne gel 5,6.
Oppklarte gels av EMSAs bruker radioaktivt merkede DNA-prober krever postrun behandling gjennom autoradiografi filmer eller et phosphorimager system for å oppdage radioaktive signaler 1,7. Geler av EMSAs ved hjelp av biotin- à eller DIG-konjugerte tre DNA-prober må også behandles og overføres til en egnet membran og deretter detektert av kjemiluminescens 6. SYBR grønn farging av gelen krever postrun gel farging og et fluorescerende skanner 4. Siden postrun gel behandlingstrinn er nødvendig for EMSAs ved hjelp av disse DNA-merkingsteknikker, kan den løses gelen bli analysert bare en gang. I motsetning til dette kan DNA-prober merket med fluoroforer bli direkte detektert i gelen på innsiden av glassplatene ved en skanner. Derfor kan DNA-protein interaksjoner bli overvåket og analysert flere ganger på forskjellige tidspunkter under kjøringen, somreduserer tiden og kostnadene betydelig. DNA-fluorescerende fargestoff konjugater som har blitt brukt for EMSAs inkluderer Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluorescein 9, og infrarøde fluorescerende fargestoffer 4-6.
Transkripsjonsregulering krever protein-DNA interaksjoner av transkripsjonsfaktorer og deres mål gener. Samordning av disse interaksjonene genererer ulike celletyper fra en felles stamfar løpet dyr utvikling. En objektiv frem genetisk skjermen identifisert en missense mutasjon, G73E, i den svært konservert HMG DNA-bindende domene av Caenorhabditis elegans transkripsjonsfaktor SOX-2. Mutasjonen resulterer i en celle identitet transformasjon av AWB olfactory nevroner i AWC olfactory nevroner på molekylære, morfologiske og funksjonelle nivåer 5,10. SOX-to forskjellig regulerer terminal differensiering av AWB og AWC nevroner ved å samhandle med kontekstavhengig partner transkripsjonsfaktorer og respektiveDNA målse 5,10. SOX-2 partnere med LIM-4 (LHX) i terminalen AWB neuronal differensiering, mens SOX-2 partnere med CEH-36 (OTX / OTD) i terminal AWC neuronal differensiering. Luciferaserapportørplasmid analyser viser at SOX-2 og mutante SOX-2 G73E proteiner har samarbeids interaksjoner med transkripsjons kofaktorer LIM-4 og CEH-36 for å aktivere en promoter uttrykt i AWB og AWC nevroner. Men SOX-2 og mutant SOX-2 G73E vises differensial aktiverings egenskapene til arrangøren. For å undersøke molekylære grunnlaget for differensial DNA-bindende aktiviteter SOX-2 og SOX-2 G73E, ble fEMSAs utført med disse proteinene og deres potensielle målse.
Først en bioinformatikk tilnærmingen ble tatt for å identifisere den biologisk relevant DNA-bindingssekvenser innenfor en kb-promoter-regionen anvendt i luciferase-assay. Siden flere potensielle SOX-2 bindingsseter var tilstede under hele promoter, vi fokusertpå predikerte SOX-to bindingssteder i tilknytning til antatte CEH-36 eller LIM-fire bindingsseter og evolusjonært konserverte mellom ulike nematode arter. Disse sekvensene ble slettet eller mutert, og deretter testet in vivo for sin aktivitet til å uttrykke GFP reporter transgener i AWB eller AWC nevroner. Gjennom denne tilnærmingen, har vi identifisert potensielle LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstøtende målse som er spesielt nødvendig for uttrykket av GFP i AWB og AWC nevroner henholdsvis fem. Vi har undersøkt de potensielle forskjeller i DNA binding av SOX-2 og SOX-2 G73E hjelp FEMSA med de identifiserte LIM-4 / SOX-2 og CEH-36 / SOX-2 tilstøtende målse. Vår EMSA analyse viste at SOX-2 G73E ikke binde DNA probe som inneholder LIM-4 / SOX-2 tilstøtende målse (som kreves for genekspresjon i AWB) så effektivt som WT SOX-2 gjorde. Men, SOX-2 og SOX-2 G73E hadde ingen forskjell i binding av DNA probe som inneholder CEH-36 / SOX-2 endjacent målområde (kreves for genekspresjon i AWC) 5,10. Våre analyser FEMSA gi mekanistisk innsikt i naturen av SOX-2 G73E mutasjon i å påvirke spesifikk DNA-bindende aktivitet for AWB-til-AWC celleidentiteten transformasjon fenotype. Her beskriver vi en optimalisert protokoll fra FEMSA å bruke rensede 6xHis-SOX-2 eller 6xHis-SOX-2 G73E sammen med infrarød fluorescerende fargestoff-merkede DNA-prober som inneholder LIM-4 / SOX-2 tilstøtende målområder som en casestudie for å takle en viktig biologisk spørsmål.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs er et effektivt verktøy for å undersøke protein-DNA-interaksjoner, og er et alternativ til radioaktiv merking av DNA. Fluorescerende fargestoffer som for eksempel infrarøde fargestoffer er kommersielt tilgjengelige, og tilveiebringe en sikrere og mer miljøvennlig metode sammenlignet med radioaktiv DNA-merking. EMSAs via infrarød fluorescerende fargestoff-merket oligonukleotider krever ikke postrun gel behandlingstrinn, og dermed spare tid og kostnader sammenlignet med andre DNA merkingsteknikker. Tiden for …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
