Ett optimerat protokoll för elektroforetisk mobilitetsförskjutningsanalys med användning av infraröda fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider
Summary
Vi beskriver här ett optimerat protokoll av fluorescerande Elektro Mobility Shift Analyser (FEMSA) med renade SOX-2-proteiner tillsammans med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta DNA-prober som en fallstudie för att ta itu med en viktig biologisk fråga.
Abstract
Elektroforetisk mobilitet förskjutningsanalyser (EMSA) är en instrumental verktyg för att karakterisera interaktioner mellan proteiner och deras mål-DNA-sekvenser. Radioaktivitet har varit den dominerande metoden för DNA-märkning EMSAs. Dock har de senaste framstegen inom fluorescerande färgämnen och scanningsmetoder föranlett användning av fluorescerande märkning av DNA som ett alternativ för radioaktivitet för fördelarna med enkel hantering, vilket sparar tid, minska kostnaderna och förbättra säkerheten. Vi har nyligen använt fluorescerande EMSA (FEMSA) för att framgångsrikt ta itu med en viktig biologisk fråga. Vår FEMSA analys ger mekanistisk insikt i effekten av en missense-mutation, G73E, i den starkt konserverade HMG transkriptionsfaktor SOX-2 på olfactory neuron typ diversifiering. Vi fann att muterade SOX-2 G73E protein förändrar specifik DNA-bindande aktivitet, varigenom lukt neuron identitet omvandling. Här presenterar vi en optimerad och kostnadseffektiv steg-för-steg-protokollför FEMSA med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider som innehåller LIM-4 / SOX-2 intilliggande målställen och renade SOX-2-proteinerna (WT och muterade SOX-2 G73E proteiner) som en biologisk exempel.
Introduction
EMSAs används för att analysera interaktioner mellan DNA och proteiner genom användning av nativt polyakrylamidgelelektrofores (PAGE) för att lösa en blandning av ett protein av intresse och en märkt DNA-sond innehållande potentiella målställen av proteinet 1. En DNA-prob som är bunden med protein kommer att migrera långsammare jämfört med en fri DNA-sond, och är därför fördröjs i sin migration genom en polyakrylamid-matris. Radiomärkning av DNA med 32 P har varit den dominerande metoden för detektering i EMSAs. Även om tillämpningen av radiomärkning i biokemisk forskning har varit fördelaktigt, är metoder för alternativa DNA märkning med jämförbar känslighet anställs på grund av hälso- och säkerhetsrisker i samband med hantering av radioaktivitet. Dessa alternativa metoder inkluderar konjugering av DNA med biotin två eller digoxigenin (DIG) 3 (av vilka båda är detekteras sedan av kemiluminiscenta system), SYBR grön färgning av PAGE-geler 4,eller direkt detektion av DNA-fluorescerande färgämne konjugat genom att skanna gelen 5,6.
De upplösta geler av EMSAs använder radioaktivt märkta DNA-sonder kräver postrun bearbetning genom autoradiografifilmer eller en fosfor system för att upptäcka radioaktiva signaler 1,7. Geler av EMSAs använder biotin två eller DIG-konjugerade tre DNA-prober måste också behandlas och överföras till ett lämpligt membran och sedan detekteras genom kemiluminescens 6. SYBR grön färgning av gelén kräver postrun gelfärgning och en fluorescerande skanner 4. Eftersom postrun gel bearbetningssteg krävs för EMSAs som använder dessa DNA märkningstekniker, kan den upplösta gelén analyseras endast en gång. I motsats härtill kan DNA-prober märkta med fluoroforer detekteras direkt i gelén inuti glasskivorna av en scanner. Därför kan DNA-proteininteraktioner övervakas och analyserades flera gånger vid olika tidpunkter under körningen, vilketavsevärt minskar tid och kostnad. DNA-fluorescerande färgämne konjugat som har använts för EMSAs inkluderar Cy3 6,8, Cy5 6,8, fluorescein 9, och infraröda fluorescerande färgämnen 4-6.
Transkriptionell reglering kräver protein-DNA interaktioner mellan transkriptionsfaktorer och deras målgener. Samordning av dessa interaktioner genererar olika celltyper från en gemensam stamfader under djurens utveckling. En opartisk framåt genetisk screen identifierat en missense-mutation, G73E, i den starkt konserverade HMG-DNA-bindande domänen av Caenorhabditis elegans transkriptionsfaktorn SOX-2. Mutationen resulterar i en cellidentiteten omvandling av AWB lukt nervceller i AWC lukt nervceller på molekylära, morfologiska och funktionella nivåer 5,10. SOX-2 reglerar differentiellt terminalen differentiering av AWB och AWC nervceller genom att interagera med kontextberoende partner transkriptionsfaktorer och respektiveDNA målställen 5,10. SOX-2 samarbetar med LIM-4 (LHX) i terminal AWB neuronal differentiering, medan SOX-2 partners med CEH-36 (OTX / OTD) i terminal AWC neuronal differentiering. Luciferasrapportör analyser visar att SOX-2 och muterade SOX-2 G73E proteiner har samarbets interaktioner med transkriptions kofaktorer LIM-4 och CEH-36 för att aktivera en promotor som uttrycks i AWB och AWC nervceller. Men SOX-2 och mutant SOX-2 G73E visas differentialaktiveringsegenskaperna hos promotorn. För att undersöka den molekylära grunden för differential DNA bindningsaktiviteter av SOX-2 och SOX-2 G73E, var fEMSAs utfördes med dessa proteiner och deras potentiella målställen.
Först en bioinformatik tillvägagångssätt för att identifiera biologiskt relevanta DNA-bindande sekvenser inom ett kb promotorregion som används i luciferas-analysen. Eftersom flera potentiella SOX-2 bindningsställen var närvarande under hela promotorn, vi fokuseradepå predikterade SOX-2-bindningsställen i anslutning till förmodade CEH-36 eller LIM-4-bindningsställen och evolutionärt konserverade mellan olika nematodarter. Dessa sekvenser togs bort eller muterad, och därefter testades in vivo för sin verksamhet att uttrycka GFP reporter transgener i AWB eller AWC nervceller. Genom detta tillvägagångssätt, identifierade vi potentiella LIM-4 / SOX-2 och CEH-36 / SOX-2 intilliggande målställen som är specifikt erforderliga för expressionen av GFP i AWB och AWC neuroner, respektive 5. Vi undersökte de eventuella skillnader i DNA-bindning av SOX-2 och SOX-2 G73E använder FEMSA med de identifierade LIM-4 / SOX-2 och CEH-36 / SOX-2 intilliggande målställen. Vår EMSA-analys visade att SOX-2 G73E inte binda DNA-sonden som innehåller LIM-4 / SOX-2 intilliggande målställen (som krävs för genuttryck i AWB) så effektivt som WT SOX-2 gjorde. Men SOX-2 och SOX-2 G73E hade ingen skillnad i bindning av DNA-sonden som innehåller CEH-36 / SOX-2adjacent målplats (krävs för genuttryck i AWC) 5,10. Vår FEMSA Analyser ger mekanistiska inblick i naturen av SOX-2 G73E mutation i påverka specifik DNA-bindande aktivitet för AWB-till-AWC cellidentitet transformation fenotyp. Här beskriver vi en optimerad protokoll för FEMSA användning av renade 6xHis-SOX-2 eller 6xHis-SOX-2 G73E tillsammans med infraröd fluorescerande färgämnesmärkta DNA-sonder som innehåller LIM-4 / SOX-2 intilliggande målställen som en fallstudie för att ta itu en viktig biologisk fråga.
Protocol
Representative Results
Discussion
fEMSAs är ett effektivt verktyg för att undersöka protein-DNA-interaktioner, och är ett alternativ till radioaktiv märkning av DNA. Fluorescerande färgämnen såsom infraröda färgämnen är kommersiellt tillgängliga, och ger en säkrare och mer miljövänlig metod jämfört med radioaktiv DNA märkning. EMSAs använder infrarött fluorescerande färgämnesmärkta oligonukleotider kräver inte postrun gel processteg, och därför sparar tid och kostnad jämfört med andra tekniker DNA märkning. Tiden för att d…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by an Alfred P. Sloan Research Fellowship (to C.-F.C.) and an NIH R01 grant (5R01GM098026-05 to C.-F.C.). We thank David Crowe for access to the advanced infrared imaging system.
Materials
| 30% Acrylamide/Bis Solution, 37.5:1 | Bio-Rad | 1610158 | Acrylamide is harmful and toxic. |
| 6x-His Epitope Tag Antibody (HIS.H8) | ThermoFisher | MA1-21315 | |
| Anti Flag M2 antibody | Sigma-Aldrich | F3165-.2MG | |
| Bovine Serum Albumin molecular-biology-grade | New England Biolabs | B9000S | |
| 5'IRDye700-labeled DNA Oligos | Integrated DNA Technologies | Custom DNA oligo | These are referred as 5'Dye-labeled or infrared fluorescent dye-labeled DNA oligos in the manuscript. The company will custom synthesize 5' IRDye labeled DNA oligonucleotides. Requires minimum 100μM scale synthesis and HPLC purification. |
| Klenow Fragment (3'–>5' exo-) | New England Biolabs | M0212S | |
| LightShif Poly (dI-dC) | ThermoFisher | 20148E | |
| Mini-PROTEAN Vertical Electrophoresis Cell | Bio-Rad | 1658000FC | This is referred as a mini protein gel system in the manuscript. Any electrophoretic system can be used as long as they are clear glass plates of less than 25cm x 25cm in size. |
| Odyssey CLx Infrared Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey CLx Infrared Imagng System | This is referred as an advanced infrared imaging system in the mansucript. |
| Odyssey Fc Imaging System | LI-COR Biotechnology | Odyssey Fc Dual-Mode Imaging System | This is referred as a near-infrared fluorescent imaging system primarily for Western blots in the mansucript. |
| Image Studio software (version 4.0) | LI-COR Biotechnology | Image Studio software | This is referred as a particular imaging software in the mansucript. |
| Orange G | Sigma-Aldrich | O3756-25G | |
| 6x Orange loading dye | 0.25% Orange G; 30% Glycerol | ||
| 0.5x TBE | 45 mM Tris-Borate; 1 mM EDTA | ||
| 1x TE | 10 mM Tris-HCl; 1 mM EDTA, pH8.0 | ||
| 1x STE | 100 mM NaCl; 10 mM Tris-HCl, pH8.0; 1 mM EDTA | ||
| 5x Binding Buffer | 50 mM Tris-HCl, pH7.5; 50 mM NaCl; 200 mM KCl; 5 mM MgCl2; 5 mM EDTA, pH8.0; 5 mM DTT; 250 ug/ml BSA |
References
- Hellman, L. M., Fried, M. G. Electrophoretic mobility shift assay (EMSA) for detecting protein-nucleic acid interactions. Nat Protoc. 2, 1849-1861 (2007).
- Ludwig, L. B., Hughes, B. J., Schwartz, S. A. Biotinylated probes in the electrophoretic mobility shift assay to examine specific dsDNA, ssDNA or RNA-protein interactions. Nucleic Acids Res. 23, 3792-3793 (1995).
- Engler-Blum, G., Meier, M., Frank, J., Muller, G. A. Reduction of background problems in nonradioactive northern and Southern blot analyses enables higher sensitivity than 32P-based hybridizations. Anal Biochem. 210, 235-244 (1993).
- Jing, D., Agnew, J., Patton, W. F., Hendrickson, J., Beechem, J. M. A sensitive two-color electrophoretic mobility shift assay for detecting both nucleic acids and protein in gels. Proteomics. 3, 1172-1180 (2003).
- Alqadah, A., et al. Postmitotic diversification of olfactory neuron types is mediated by differential activities of the HMG-box transcription factor SOX-2. EMBO J. 34, 2574-2589 (2015).
- Jullien, N., Herman, J. P. LUEGO: a cost and time saving gel shift procedure. Biotechniques. 51, 267-269 (2011).
- Poulin-Laprade, D., Burrus, V. Electrophoretic Mobility Shift Assay Using Radiolabeled DNA Probes. Methods Mol Biol. 1334, 1-15 (2015).
- Ruscher, K., et al. A fluorescence based non-radioactive electrophoretic mobility shift assay. J Biotechnol. 78, 163-170 (2000).
- Pagano, J. M., Clingman, C. C., Ryder, S. P. Quantitative approaches to monitor protein-nucleic acid interactions using fluorescent probes. RNA. 17, 14-20 (2011).
- Alqadah, A., Hsieh, Y. W., Chuang, C. F. Sox2 goes beyond stem cell biology. Cell cycle. , (2016).
- Larouche, K., Bergeron, M. J., Leclerc, S., Guerin, S. L. Optimization of competitor poly(dI-dC).poly(dI-dC) levels is advised in DNA-protein interaction studies involving enriched nuclear proteins. Biotechniques. 20, 439-444 (1996).
- Sorenson, A. E., Schaeffer, P. M. In-gel detection of biotin-protein conjugates with a green fluorescent streptavidin probe. Anal. Methods. 7, 2087-2092 (2015).
- Onizuka, T., Endo, S., Hirano, M., Kanai, S., Akiyama, H. Design of a fluorescent electrophoretic mobility shift assay improved for the quantitative and multiple analysis of protein-DNA complexes. Biosci Biotechnol Biochem. 66, 2732-2734 (2002).
- Steiner, S., Pfannschmidt, T. Fluorescence-based electrophoretic mobility shift assay in the analysis of DNA-binding proteins. Methods Mol Biol. 479, 273-289 (2009).
