Un protocole optimisé pour la mobilité électrophorétique Maj Assay utilisant Oligonucleotides infrarouge Fluorescent Dye marqués

Résumé

Nous décrivons ici un protocole optimisé de électrophorétiques Assays Mobility Shift fluorescentes (FEMSA) en utilisant SOX-2 protéines purifiées avec infrarouges fluorescentes sondes d'ADN marquées par un colorant comme une étude de cas pour aborder une question biologique importante.

Résumé

Les analyses électrophorétiques de décalage de mobilité (EMSA) sont un outil instrumental pour caractériser les interactions entre les protéines et leurs séquences d'ADN cibles. Radioactivité a été la principale méthode de marquage d'ADN dans EMSA. Cependant, les progrès récents dans les colorants fluorescents et les méthodes d'analyse ont conduit à l'utilisation d'un marquage fluorescent de l'ADN comme une alternative à la radioactivité pour les avantages de la facilité de manipulation, un gain de temps, ce qui réduit le coût et en améliorant la sécurité. Nous avons récemment utilisé EMSA fluorescent (FEMSA) pour traiter avec succès une question biologique importante. Notre analyse FEMSA fournit une approche mécanistique dans l'effet d'une mutation faux-sens, G73E, dans le HMG facteur de transcription SOX-2 hautement conservée sur la diversification du type de neurone olfactif. Nous avons constaté que mutantes SOX-2 protéines ^G73E modifie l' activité de liaison spécifique de l' ADN, provoquant ainsi olfactive transformation identitaire des neurones. Ici, nous présentons un optimisé et rentable, étape par étape protocolepour FEMSA en utilisant des oligonucléotides marqués par un colorant fluorescent infrarouge contenant les LIM-4 / SOX-2 sites cibles adjacents et purifiés SOX-2 protéines (WT et mutantes SOX-2 protéines ^G73E) comme un exemple biologique.

Introduction

EMSA sont utilisés pour analyser les interactions entre l' ADN et les protéines en utilisant l' électrophorèse sur gel de polyacrylamide natif (PAGE) pour résoudre un mélange d'une protéine d'intérêt et une sonde d'ADN marquée contenant des sites cibles potentiels de la protéine ^1. Une sonde d'ADN liée à la protéine migre plus lentement par rapport à une sonde d'ADN libre, et est donc retardé dans sa migration à travers une matrice de polyacrylamide. Le marquage radioactif de l' ADN par ^32P a été la principale méthode pour la détection dans EMSA. Bien que l'application de radiomarquage dans la recherche biochi....

Protocole

REMARQUE: Les EMSA en utilisant des sondes d'ADN marquées par fluorescence ou d' autres formes d'ADN marqué partagent les mêmes protocoles pour une protéine ou d'une préparation d'extrait cellulaire, la réaction de liaison protéine-ADN, et la préparation du gel PAGE et l' exécution (figure 1A). Les principales différences sont des procédures d'ADN d'étiquetage, post-exécution des étapes de traitement de gel, et les méthodes de détection.

1. Préparation du gel

1. Préparer 5% de gel de Polyacrylamide natif contenant 0,5 x TBE (45 mM de Tris-borate, 1 mM EDTA) et 2,5% de glycerol, en utilisant un système d....

Résultats

Orange G colorant de chargement (6x: 0,12 g d'orange G dans 100 ml de glycerol à 30%) peut être ajouté à la réaction de liaison avant le chargement de visualiser la progression de l'électrophorèse. D' autres colorants de chargement , y compris le bleu de bromophénol seront détectés lors de la numérisation et donc interférer avec l' analyse d'image (figure 1B).

Dans certains cas d'EMSA, .......

Discussion

fEMSAs sont un outil efficace pour étudier les interactions protéine-ADN, et sont une alternative à un marquage radioactif de l'ADN. Les colorants fluorescents tels que les colorants infrarouges sont disponibles dans le commerce, et de fournir une méthode plus sûre et plus respectueuse de l'environnement par rapport à l'étiquetage radioactif de l'ADN. EMSA utilisant fluorescentes infrarouge oligonucléotides marqués par un colorant ne nécessitent pas d'étapes postrun de traitement de gel, et donc de g.......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
Solution d’acrylamide/bis à 30 %, 37,5:1	Bio-Rad	1610158	Acrylamide est nocif et toxique.
6x-his Epitope Tag Anticorps (HIS. H8)	ThermoFisher	MA1-21315
Anticorps anti-drapeau M2	Sigma-Aldrich	F3165-.2MG
Albumine sérique bovine (BSA) grade de biologie moléculaire	New England Biolabs	B9000S
5'IRDye700 Technologies d’ADN		intégrées Oligos d’ADN personnalisés	Ces oligos sont appelés « oligos d’ADN marqués à un colorant 5' ou marqués à un colorant fluorescent infrarouge » dans le manuscrit. La société synthétisera sur mesure des oligonucléotides d’ADN marqués 5' IRDye. Nécessite un minimum de 100 &mu ; Synthèse à l’échelle M et purification HPLC.
Klenow Fragment (3'-->5' exo-)	New England Biolabs	M0212S
LightShif Poly (dI-dC)	ThermoFisher	20148E
Mini-PROTEAN  ; Cellule d’électrophorèse verticale	Bio-Rad	1658000FC  ;	C’est ce qu’on appelle un « système de mini gel protéique » dans le manuscrit. N’importe quel système électrophorétique peut être utilisé à condition qu’il s’agisse de plaques de verre transparent de moins de 25 cm x 25 cm.
Système d’imagerie infrarouge Odyssey CLx	LI-COR Biotechnology	Système d’imagerie infrarouge Odyssey CLx	Ce système est appelé « système d’imagerie infrarouge avancé » dans le manuscrit.
Système d’imagerie Odyssey fc  ;	d’imagerie bimode	LI-COR Biotechnology	appelé « système d’imagerie fluorescent proche infrarouge principalement pour les transferts Western » dans le manuscrit.
Logiciel Image Studio (version 4.0)	Logiciel LI-COR Biotechnology	Image Studio  ;	C’est ce qu’on appelle un « logiciel d’imagerie particulier » dans le manuscrit.
Orange G	Sigma-Aldrich	O3756-25G
6x Colorant			0,25 % Orange G ; 30 % Glycérol
0,5x TBE			45 mM Tris-Borate ; 1 mM EDTA
1x TE			10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 1 mM EDTA
1x STE			100 mM NaCl ; 10 mM Tris-HCl, pH 8,0 ; 1 mM
EDTA 5x tampon			de liaison50 mM de Tris-HCl, pH 7,5 ; 50 mM de NaCl ; 200 mM KCl ; 5 mM de MgCl2 ; 5 mM d’EDTA, pH de 8,0 ; 5 mM TNT ; 250 et #956 ; g/mL BSA

Oligos d’ADN marqués Système Odyssey Fc Ce système est de charge orange