Dalma Donma: Transmisyon Elektron Mikroskobu içinde Süspansiyon Hücrelerinin ultrastrüktürel ve immünolokalizasyonu Çalışmaları için Aracı
Summary
Bu makale, transmisyon elektron mikroskobu ile süspansiyon hücreleri görselleştirme için bir kullanımı kolay ve düşük maliyetli bir cryofixation yöntemini tarif etmektedir.
Abstract
İletim Elektron Mikroskobu (TEM), proteinleri lokalize etmek ve macromoleküler kompleksleri çok yüksek çözünürlükte görselleştirmek için hücre altyapısını incelemek için olağanüstü bir araçtır. Bununla birlikte, doğa devletine olabildiğince yakın olabilmek için, mükemmel örnek muhafaza edilmesi gerekiyor. Örneğin, aldehitlerle konvansiyonel elektron mikroskopisi (EM) fiksasyonu, iyi bir ultrastrüktürel koruma sağlamaz. Sabitleştiricilerin yavaş nüfuz etmesi hücrenin yeniden düzenlenmesini ve çeşitli hücre bileşenlerini kaybetmesini sağlar. Bu nedenle, klasik EM fiksasyonu yapıların anlık statikleşmesini ve korunmasını ve antijenikliğine izin vermez. Hücre içi olayları incelemek için en iyi seçim, hücreleri kendi doğal hallerinde tutan dondurma-ikame sabitleme yönteminin ardından kriyofizasyonu kullanmaktır. Hücresel altyapı bütünlüğünü koruyan yüksek basınçlı dondurma / dondurma ikamesi, en sık kullanılan yöntemdir, ancak maliyeti gerektirirekipmanı ettik. Burada, süspansiyon hücre kültürleri için dondurularak ikamesi ile devam kullanımlı kolay ve düşük maliyetli dondurarak sabitleme yöntemi sunulmuştur.
Introduction
Örnek hazırlama herhangi elektron mikroskopisi çalışmanın başarısı için kritik öneme sahiptir. Geleneksel EM sabitleme transmisyon elektron mikroskopisi (TEM) 1 için doku veya hücrelerin sabitlenmesi için birincil yöntem oldu. İlk olarak, aldehit ve ozmiyum tetroksit kimyasal olarak oda sıcaklığında malzeme sabitlemek için kullanılır. Daha sonra, malzeme, organik çözücüler ile dehidre infiltre ve epoksi reçine içine gömülü olan. Bu yöntem, hücre içine fiksatif nüfuz hızına bağlıdır. Sonuç olarak, hücre içerikleri eserler ve ekstraksiyon, genellikle 2 görülmektedir.
Cryofixation açık hücresel yapıların 3 korunması için daha iyi bir alternatif, onları etkilemeden onlara tutuyor. Ince bir reçine bölümlerde TEM görüntüleri 4 yüksek kalitede cryofixation / dondurma ikame yöntem kullanılarak elde edilebilir. Bu tekniğin amacı vitrifiye bi elde etmektirBuz kristallerinin oluşumu ya da hücrelerin ultrastrüktürel zarar vermemek için yeterince küçük içeren buz kristalleri olmadan ological örnekleri. Yüksek basınçlı dondurma (HPF) ve aynı zamanda (PF) dondurma dalma denir ultra hızlı cryofixation, numune cryofix için iki yöntem bulunmaktadır. HPF anlık hücrede molekülleri immobilize eden ve geleneksel EM tespit neden olduğu zarar görmesini engeller. Donma makineleri ve otomatik ikame cihazlarının çeşitli tipleri 5 geliştirilmiştir. Dondurma makinesi ve malzemeler (sıvı azot, vb taşıyıcılar, numune) pahalıdır, ancak yüksek kaliteli bir elektron mikrograflannı 6, 7 üretmek için izin verir. PF 1950'lerin başında kullanılan ve basit ve PF prosedürü sırasında bu şirketin 8 ucuz, hazırlanan numune, buz kristallerinin en az 3 mil 5 için boyutu elde etmek için hızla dondurulur olarak literatürde tarif edilen bir tekniktir. Bu amaçla, örnekörneğin, etan, propan, ya da etan-propan karışımı gibi bir sıvı cryojen daldırıldı. 1950 yılından bu yana, PF iyileştirmeler kullanıcıların daha fazla sayıda bu teknik kullanılabilir hale getirmek için yapılmıştır. PF yaygın (görüntü küçük nesneleri için kullanılır ise yüksek basınç dondurma, şu anda daha kalın 50 5 um (disk şeklindeki numuneler için 200 um bir kalınlığa kadar) Numunelerin büyük bir çeşitlilik dondurmak için tek uygun bir şekilde <100 nm ), şekilsiz bir buz 9'un ince bir film içerisinde süspanse makromoleküler kompleksler gibi. Büyük örnekler, örneğin, ökaryotik hücreler için, PF cryofixed, ancak bu tür kılcal boru veya sandviç sistemleri 8, 10, 11 ya da numune tutucu, gerektirir.
Burada, hızlı, kolay kullanımlı ve çeşitli süspansiyon hücre kültürleri için kullanılabilir düşük maliyetli dalma donma / dondurularak ikame teknolojisi sunulmuştur.
Protocol
Representative Results
Discussion
TEM organeller, hücreler ve dokuların ultrastrüktürel gözlem için güçlü bir yöntemdir. Cryofixation / dondurularak ikame anda hem ince yapısı ve protein antijenisite korunması için en iyi yöntemdir. Kimyasal fiksatifler nüfuz ve ultrastrüktürün 2 tam istikrarlı önce yapısal yeniden düzenlemeleri sağlayan çok yavaş bir şekilde hareket ederler. Tersine, cryofixation / dondurularak ikamesi anında hücresel yapılar 4 dengeler. Bununla birlikte, cry…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Biz el yazması üzerine yardım ve yorumlar için M. Bouchecareilh E. Tétaud S. Duvezin-CAUBET, ve A. Devin şükranlarımızı sunuyoruz. Biz görüntüleri alındı Bordo Görüntüleme Merkezi'nin elektronik görüntüleme kutbuna müteşekkiriz. Bu çalışma Centre National de la Recherche Scientifique tarafından desteklendi.
Materials
| Grids | Electron Microscopy Sciences | T400-Cu | |
| Formvar | Electron Microscopy Sciences | 15800 | |
| Propane N35 | |||
| Liquid nitrogen | |||
| Double edge dissecting needle | Electron Microscopy Sciences | 72947 | |
| Cryovials | Electron Microscopy Sciences | 61802-02 | |
| Osmium tetroxide | Electron Microscopy Sciences | 19130 | |
| Glass vial 8,5 ml | Electron Microscopy Sciences | 64252 | |
| Uranyl acetate | Electron Microscopy Sciences | 48851 | |
| Acetone | Sigma | 32201 | |
| Ethanol 100% | Sigma | 32221 | |
| Glass slides | VWR international | 631-9439 | |
| Tweezers | |||
| Acrylic resin | Electron Microscopy Sciences | 104371 | |
| Epoxy resin M | Sigma | 10951 | |
| Epoxy resin M hardener | Sigma | 10953 | |
| Dibutyl phtalate | Sigma | 80102 | |
| Epoxy resin M accelerateur | Sigma | 10952 | |
| Crystallizer | Fischer scientific | 08-762-9 | |
| Joseph paper | VWR international | 111-5009 | |
| Brass cups | do it yourself shop or made by yourself | ||
| Saccharomyces cerevisiae | |||
| Shizosacharomyces cerevisiae | |||
| Trypanosoma brucei | |||
| Leishmania amazonensis | |||
| Escherichia Coli | |||
| Airtight box | Fischer scientific | 7135-0001 | |
| Air purifying respirator | Fischer scientific | 3M 7502 | |
| Cartridge for respirator | Fischer scientific | 3M 6001 | |
| Particulate filter | Fischer scientific | 3M 5N11 |
References
- Palade, G. E., Porter, K. R. Studies on the endoplasmic reticulum. I. Its identification in cells in situ. J Exp Med. 100 (6), 641-656 (1954).
- Kellenberger, E., Johansen, R., Maeder, M., Bohrmann, B., Stauffer, E., Villiger, W. Artefacts and morphological changes during chemical fixation. J Microsc. 168 (Pt 2), 181-201 (1992).
- Studer, D., Humbel, B. M., Chiquet, M. Electron microscopy of high pressure frozen samples: bridging the gap between cellular ultrastructure and atomic resolution. Histochem Cell Biol. 130 (5), 877-889 (2008).
- McDonald, K. L. Out with the old and in with the new: rapid specimen preparation procedures for electron microscopy of sectioned biological material. Protoplasma. 251, 429-448 (2014).
- Studer, D., Graber, W., Al-Amoudi, A., Eggli, P. A new approach for cryofixation by high-pressure freezing. J Microsc. 203 (Pt 3), 285-294 (2001).
- Bernales, S., McDonald, K. L., Walter, P. Autophagy counterbalances endoplasmic reticulum expansion during the unfolded protein response. PLoS Biol. 4 (12), 2311-2324 (2006).
- Kissová, I., Salin, B., Schaeffer, J., Bhatia, S., Manon, S., Camougrand, N. Selective and non-selective autophagic degradation of mitochondria in yeast. Autophagy. 3 (4), 329-336 (2007).
- Gilkey, J. C., Staehling, A. Advances in ultrarapid freezing for the preservation of cellular ultrastructure. Microsc Res Tech. 3 (2), 177-210 (1986).
- Nogales, E., Scheres, S. H. Cryo-EM: A Unique Tool for the Visualization of Macromolecular Complexity. Mol Cell. 58 (4), 677-689 (2015).
- Baba, M. Electron microscopy in yeast. Methods Enzymol. 451, 133-149 (2008).
- Leunissen, J. L. M., Yi, H. Self-pressurized rapid freezing (SPRF): a novel cryofixation method for specimen preparation in electron microscopy. J Microsc. 235 (1), 25-35 (2009).
- Lefebvre, M., et al. LdFlabarin a new BAR domain membrane protein of Leishmania flagellum. PLoS One. 8 (9), 1-12 (2013).
- Tetaud, E., et al. TbFlabarin, a flagellar protein of Trypanosoma brucei, highlights differences between Leishmania and Trypanosoma flagellar-targeting signals. Exp Parasitol. 166, 97-107 (2016).
- Wasmer, C., et al. Solid-state NMR spectroscopy reveals that E coli inclusion bodies of HET-s(218-289) are amyloids. Angew Chem Int Ed Engl. 48 (26), 4858-4860 (2009).
- Lefebvre-Legendre, L., et al. Failure to assemble the alpha 3 beta 3 subcomplex of the ATP synthase leads to accumulation of the alpha and beta subunits within inclusion bodies and the loss of mitochondrial cristae in Saccharomyces cerevisiae. J Biol Chem. 280 (18), 18386-18389 (2005).
- Paumard, P., et al. The ATP synthase is involved in generating mitochondrial cristae morphology. EMBO J. 21 (3), 221-230 (2002).
- Gabriel, F., et al. A Fox2-dependent fatty acid ß-oxidation pathway coexists both in peroxisomes and mitochondria of the ascomycete yeast Candida lusitaniae. PLoS One. 9 (12), 1-27 (2014).
- Dubochet, J. The physics of rapid cooling and its implications for cryoimmobilization of cells. Methods Cell Biol. 79, 7-21 (2007).
- Meryman, H. T. Cryopreservation of living cells: principles and practice. Transfusion. 47 (5), 935-945 (2007).
- Vanhecke, D., Graber, W., Studer, D. Close-to-native ultrastructural preservation by high pressure freezing. Methods Cell Biol. 88, 151-164 (2008).
- Bobik, K., Dunlap, J. R., Burch-Smith, T. M. Tandem high-pressure freezing and quick freeze substitution of plant tissues for transmission electron microscopy. J Vis Exp. (92), e51844 (2014).
- Pinan-Lucarré, B., Clavé, C. Monitoring autophagy in the filamentous fungus Podospora anserina. Methods Enzymol. 451, 251-270 (2008).
- Follet-Gueye, M. L., Pagny, S., Faye, L., Gomord, V., Driouich, A. An improved chemical fixation method suitable for immunogold localization of green fluorescent protein in the Golgi apparatus of tobacco Bright Yellow (BY-2) cells. J Histochem Cytochem. 51 (7), 931-940 (2003).
- Jesus, D. M., Moussatche, N., Condit, R. C. An improved high pressure freezing and freeze substitution method to preserve the labile vaccinia virus nucleocapsid. J Struct Biol. 195 (1), 41-48 (2016).
