Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

Bogumila Swietek; Akshay Gupta; Archana Proddutur; Vijayalakshmi Santhakumar

doi:10.3791/54880

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Article de méthode

Immunocoloration des articles biocytine remplis et transformés pour neurochimiques Marqueurs

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DOI :

10.3791/54880

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31 décembre 2016

Bogumila Swietek¹ , Akshay Gupta² , Archana Proddutur² , Vijayalakshmi Santhakumar²

¹Graduate School of Biomedical Sciences, Rutgers New Jersey Medical School, ²Department of Pharmacology, Physiology and Neuroscience, Rutgers New Jersey Medical School

Dans cet article

Résumé

Ce protocole présente un procédé pour la récupération morphologique des neurones corrigés lors des enregistrements électrophysiologiques en utilisant le remplissage de la biocytine et de post-traitement immunohistochimique ultérieure. Nous montrons que les sections de biocytin rempli d'épaisseur qui ont été colorées et sous une lamelle peuvent être recolorées avec un deuxième jours ou des mois d'anticorps primaires plus tard.

Résumé

Enregistrements électrophysiologiques des cellules en utilisant la technique du patch clamp ont permis l'identification de différents types de neurones en fonction des modèles de tir. L'inclusion de biocytin / neurobiotin dans l'électrode d'enregistrement permet la récupération post-hoc des détails morphologiques, qui sont nécessaires pour déterminer l'arborisation dendritique et les régions ciblées par les axones des neurones enregistrés. Toutefois, étant donné la présence de neurones morphologiquement similaires avec des identités et des fonctions neurochimiques distinctes, la coloration immunohistochimique pour les protéines cellule de type spécifique est essentiel d'identifier définitivement les neurones. Pour maintenir la connectivité de réseau, des sections de cerveau pour les enregistrements physiologiques sont préparées à une épaisseur de 300 um ou plus. Toutefois, cette épaisseur empêche souvent le post-traitement immunohistochimique à cause de problèmes avec la pénétration de l'anticorps, ce qui nécessite la résection du tissu. Résection de tranches est un art difficile, Resul souventtion de la perte de tissu et de la morphologie des cellules à partir desquelles les données électrophysiologiques ont été obtenus, ce qui rend les données inutilisable. Etant donné que la récupération de la morphologie limiterait la perte de données et le guide dans le choix des marqueurs neuronaux, nous avons adopté une stratégie de récupération de la morphologie des cellules en premier, suivi par immunocoloration secondaire. Nous introduisons une approche pratique pour biocytin remplissage pendant les enregistrements physiologiques et immunocoloration série subséquente pour la récupération de la morphologie, suivie par la recoloration des sections pour déterminer l'identité neurochimique. Nous rapportons que les articles qui ont été remplis avec biocytin, fixés avec du paraformaldehyde (PFA), colorées, et sous une lamelle peuvent être enlevés et recolorées avec un deuxième jours d'anticorps primaires plus tard. Cette recoloration implique la suppression de la lamelle couvre-objet, le lavage des coupes dans une solution tampon et l'incubation des anticorps primaires et secondaires afin de révéler l'identité neurochimique. Le procédé est avantageux pour l'élimination datune perte due à l'incapacité de recouvrer la morphologie et pour réduire la liste des marqueurs neurochimiques à tester sur la base de la morphologie.

Introduction

Le cerveau est connue pour la diversité dans les caractéristiques structurelles et fonctionnelles de ses éléments neuronaux individuels. Comprendre les rôles des types de neurones distincts dans le fonctionnement du cerveau et de la pathologie nécessite la caractérisation et l'identification sans ambiguïté des neurones. Structurellement, les caractéristiques morphologiques définies par emplacement somato-dendritique déterminent les entrées potentielles qu'un neurone donné reçoit, tandis que le modèle d'arborisation axonale identifie des cibles postsynaptiques potentiels. La diversité structurelle des neurones a été apprécié depuis les journées d'étude....