Colon-26 karsinom Tumor-bærende mus som en modell for studier av kreft kakeksi

Summary

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Abstract

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality¹. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma^2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength^3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)³, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism². Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Introduction

Muskelsvinn er en alvorlig komplikasjon av forskjellige kliniske tilstander så som kreft, sepsis, lever, skrumplever, hjerte og nyresvikt, kronisk obstruktiv lungesykdom, og AIDS. Spesielt er muskelsvinn tydelig i minst 50% av pasienter med cancer ^en. Tap av skjelettmuskulatur hos kreft resultater fra økt protein degradering på grunn av over-aktivering av skjelettmuskel proteolytiske systemer og / eller fra redusert proteinsyntese ^6. Lipolyse er også tydelig, noe som fører til uttømming av fettvev. Klinisk, kakeksi er assosiert med redusert kvalitet og levetid og er beregnet for å være årsaken til død hos 20 – 30% av kreftpasienter ^7. Bruk av eksperimentelle modeller som ligner den humane sykdommen så tett som mulig ville være fordelaktig. En optimal dyremodell er kjennetegnet ved høy reproduserbarhet, så vel som ved begrenset interferens fra forskjellige behandlinger, og de uforutsigbare faktorenekosthold, sex, og genetisk bakgrunn som vanligvis er forbundet med den kliniske tilstanden ^8. Så langt har kreft kakeksi blitt studert i dyremodeller hovedsakelig kjennetegnet ved transplantasjon av kreftceller eller injeksjon av kreftfremkallende, selv om en ny metode er å bruke genetisk modifiserte mus som er mottakelige for utvikling av kreft.

Mus som bærer C26 karsinom (også referert til som kolon-26 og adenokarsinom) representerer en godt karakterisert og brukt i stor utstrekning modell av kreft kakeksi ^2,5. Veksten av C26 tumor resultater i kropp og muskler vekttap, hovedsakelig gjennom økt fett og protein katabolisme ^9. Vanligvis er en 10% tumorvekten i forhold til den totale kroppsvekten i forbindelse med en reduksjon på 20-25% i skjelettmuskel vekt og en større nedbryting av fett ^3,10. Hepatomegali og splenomegali er også observert med tumorvekst, sammen med aktiveringen av akutt faserespons og heving av pro-oppblåstmmatory cytokin nivåer ^3,11. Blant disse er det vel kjent at IL-6 spiller en sentral rolle som formidler muskelsvinn i C26-modellen, selv om dette cytokin er nok ikke den eneste induser av kakeksi ^12. Forhøyet IL-6 forårsaker muskelatrofi gjennom aktivering av JAK / STAT3 vei, og hemme denne transkripsjonsfaktor kan forebygge muskel sløse ^3,4.

Under C26-indusert muskelsvinn, som i mange tilstander i muskler atrofi, er muskelmasse tapt i stor grad gjennom reduksjoner i muskelproteininnhold på tvers av muskelfibrene, ikke gjennom celledød eller tap av fibre ^13. I C26 kakeksi, er en dreining mot mindre tverrsnittsareal observert i både glykolytiske og oksidative fibre ^2. Dette er også i overensstemmelse med redusert muskelstyrke ^5. Mange grupper over hele verden har tatt fordel av C26-modellen for å oppdage nye mediatorer av muskelsvinn eller klinisk relevante legemidler for kreft cachexia. Imidlertid har mange forskjellige prosedyrer for bruk av denne modellen har blitt rapportert, heve bekymringer om konsistensen av de innhentede data og poserer barrierer for å reproduserbarhet i ulike eksperimentelle forhold. Her kan vi rapportere en typisk anvendelse av denne modell for studiet av kreft kakeksi som gir standardiserte og reproduserbare data.

Protocol

Etikk Uttalelse: Alle studiene beskrevet ble godkjent av Institutional Animal Care og bruk komiteer Thomas Jefferson University og Indiana University School of Medicine. 1. C26 cellevekst og klargjøring Oppnå C26 kolorektal kreftceller (Ohio State University Medical Center (OSUMC)) og forberede komplett vekstmedium (dvs. høy-glukose Dulbeccos modifiserte Eagles medium (DMEM) inneholdende 10% føtalt bovint serum (FBS), 1 mM natriumpyruvat, 1% glutamin og 1% streptomyci…

Representative Results

C26 tumorvekstkinetikk viser et etterslep fase for den første 7 – 8 d etter injeksjon, etterfulgt av eksponensiell cellevekst (4 – 5 d). Tumormassen kommer til slutt ~ 10% av kroppsvekt (ca. 2 g; Figur 1A-B). Under den første fase, kan tumoren være plassert ved palpasjon bare og ser ut som en liten utvekst av huden. I den andre fasen, er svulsten observert som en masse under huden. Sjelden blir svulsten sårdannelse, noe som resulterer i et åpent så…

Discussion

Spesielt i sin nyeste stadier, er tykktarmskreft assosiert med utvikling av kakeksi, som er ansvarlig for dårligere utfall og reduksjon i pasientens livskvalitet. Mange studier har fokusert på behandling av tilstander som sekundært til cancer; Men til tross for mange forsøk i denne retningen, er det fortsatt ingen godkjente behandling for kreft kakeksi ^21. Således er det viktig at dyremodeller ligner den humane patologi så tett som mulig for å maksimere den oversettelse av funnene.

<p class="jove_c…

Materials

Cell culture Flasks	Falcon – Becton Dickinson	35-5001
DMEM	Cellgro	10-017-CV
FBS	Gibco	26140
Streptomycin-Penicillin	Cellgro	30-002-CI
CD2F1 mice	Harlan	060
Anesthesia apparatus	EZ-Anesthesia	EZ-7000
2-Methyl Butane	Sigma-Aldrich	M32631
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Cork disks	Electron Microscopy Sciences	63305
Superfrost plus glass slides	VWR	48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody	Vector Laboratories	VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21211
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110332
Xylene	Acros Organics	422680025
Cytoseal-XYL	Thermo	8312-4
Microscope	Zeiss	Observer.Z1
Bamboo Tablet	Wacom	CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011	Microsoft Corp.
Image J	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer	BD	365873