كولون-26 سرطان الفأر نموذجا لدراسة سرطان دنف الحاملة للورم
Summary
Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.
Abstract
Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality1. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)3, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism2. Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.
Introduction
هزال العضلات هو من مضاعفات خطيرة من مختلف الحالات السريرية مثل السرطان، وتعفن الدم والكبد وتليف الكبد والقلب والفشل الكلوي، ومرض الانسداد الرئوي المزمن، ومرض الإيدز. على وجه الخصوص، هزال العضلات هو واضح في ما لا يقل عن 50٪ من المرضى الذين يعانون من سرطان 1. فقدان العضلات والهيكل العظمي في نتائج السرطان من زيادة تدهور البروتين بسبب الإفراط في تفعيل الهيكل العظمي عضلة بروتين و / أو من انخفاض تخليق البروتين 6. تحلل الدهون واضح أيضا، مما يؤدي إلى استنزاف الأنسجة الدهنية. ويرتبط سريريا، دنف مع انخفاض الجودة وطول العمر، ويقدر أن يكون سبب الوفاة في 20 – 30٪ من مرضى السرطان 7. ان استخدام النماذج التجريبية التي تشبه الأمراض التي تصيب البشر قدر الإمكان أن يكون مفيدا. يتميز نموذج حيواني الأمثل عن طريق استنساخ عالية، فضلا عن تدخل محدود من العلاجات المختلفة وعوامل لا يمكن التنبؤ بهاالنظام الغذائي والجنس والخلفية الوراثية التي ترتبط عادة مع حالة سريرية 8. حتى الآن، وقد تم دراسة سرطان دنف أساسا في النماذج الحيوانية تتميز زرع الخلايا السرطانية أو حقن المواد المسببة للسرطان، على الرغم من أن الأسلوب الجديد هو استخدام الفئران المعدلة وراثيا عرضة لتطوير مرض السرطان.
الفئران تحمل سرطان C26 (كما يشار إلى القولون-26 وغدية) تمثل نموذجا تتميز جيدا وتستخدم على نطاق واسع من سرطان دنف 2،5. نمو الورم النتائج C26 في الجسم وفقدان الوزن العضلات، وذلك أساسا من خلال تعزيز الدهون والبروتين هدم 9. عموما، يرتبط 10٪ وزن الورم مقابل إجمالي وزن الجسم مع الحد من 20-25٪ في الهيكل العظمي وزن العضلات واستنزاف أكبر من الدهون 3،10. لوحظ تضخم الكبد وتضخم الطحال أيضا مع نمو الورم، جنبا إلى جنب مع تفعيل استجابة المرحلة الحادة وارتفاع المؤيدة للinflaمستويات خلوى mmatory 3،11. ومن بين هؤلاء، فمن المعروف أن IL-6 يلعب دورا محوريا في الوساطة هزال العضلات في نموذج C26، على الرغم من أن هذه خلوى ربما لا يكون محفز الوحيد من دنف 12. مرتفعة IL-6 يسبب ضمور العضلات من خلال تفعيل المسار JAK / STAT3، ويمكن أن تحول دون هذا عامل النسخ منع تلف العضلات 3،4.
خلال هزال العضلات الناجم عن C26، كما هو الحال في كثير من ظروف ضمور العضلات، وفقدان كتلة العضلات إلى حد كبير من خلال تخفيضات في محتوى البروتين في العضلات عبر الألياف العضلية، وليس من خلال موت الخلايا أو فقدان الألياف 13. في C26 دنف، ويلاحظ التحول نحو مناطق أصغر مستعرضة في كل حال السكر والأكسدة الألياف 2. وهذا أيضا يتفق مع انخفاض قوة العضلات 5. وقد اتخذت العديد من الجماعات في جميع أنحاء العالم الاستفادة من نموذج C26 من أجل اكتشاف وسطاء جديدة من تلف العضلات أو الأدوية ذات الصلة سريريا لكاك السرطانhexia. ومع ذلك، فقد تم الإبلاغ عن العديد من الإجراءات المختلفة لاستخدام هذا النموذج، مما أثار مخاوف بشأن اتساق البيانات التي تم الحصول عليها وتشكل الحواجز التي تحول دون استنساخ في ظروف تجريبية مختلفة. نحن هنا الإبلاغ عن الاستخدام النموذجي لهذا النموذج لدراسة دنف السرطان الذي ينتج بيانات موحدة وقابلة للتكرار.
Protocol
Representative Results
Discussion
خصوصا في آخر مراحله، ويرتبط سرطان القولون والمستقيم مع تطور دنف، وهي المسؤولة عن النتائج وتخفيضات في نوعية حياة المريض الفقيرة. وقد ركزت العديد من الدراسات على علاج الحالات الثانوية للسرطان. ومع ذلك، على الرغم من جهود عديدة في هذا الاتجاه، لا يوجد حتى الآن علاج المع?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank Richard Lieber and Shannon Bremner for their ImageJ macro and instructions. While at Thomas Jefferson University, this work was supported by the Pennsylvania Department of Health CURE Grant TJU No. 080-37038-AI0801. Subsequently, this study was supported by a grant to AB from the National Institutes of Health (R21CA190028), and by grants to TAZ from the National Institutes of Health (R01CA122596, R01CA194593), the IU Simon Cancer Center, the Lustgarten Foundation, the Lilly Foundation, Inc., and the IUPUI Pancreas Signature Center.
Materials
| Cell culture Flasks | Falcon – Becton Dickinson | 35-5001 | |
| DMEM | Cellgro | 10-017-CV | |
| FBS | Gibco | 26140 | |
| Streptomycin-Penicillin | Cellgro | 30-002-CI | |
| CD2F1 mice | Harlan | 060 | |
| Anesthesia apparatus | EZ-Anesthesia | EZ-7000 | |
| 2-Methyl Butane | Sigma-Aldrich | M32631 | |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | |
| Cryostat | Leica | CM1850 | |
| Cork disks | Electron Microscopy Sciences | 63305 | |
| Superfrost plus glass slides | VWR | 48311-703 | |
| Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody | Sigma-Aldrich | L9393 | |
| Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody | Vector Laboratories | VP-D508 | |
| Alexa Flour 594 anti-mouse IgG | Life Technologies | A11062 | |
| Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG | Life Technologies | A21211 | |
| Hematoxylin | Sigma-Aldrich | GHS216 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | HT110332 | |
| Xylene | Acros Organics | 422680025 | |
| Cytoseal-XYL | Thermo | 8312-4 | |
| Microscope | Zeiss | Observer.Z1 | |
| Bamboo Tablet | Wacom | CTH-661 | |
| Prism 7.0 for Mac OS X | GraphPad Software, Inc. | ||
| Excel for Mac 2011 | Microsoft Corp. | ||
| Image J | US National Institutes of Health | IJ1.46 | http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html |
| Microtainer | BD | 365873 |
References
- Tan, B., Fearon, K. Cachexia: prevalence and impact in medicine. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 11, 400-407 (2008).
- Aulino, P., et al. Molecular cellular and physiological characterization of the cancer cachexia-inducing C26 colon carcinoma in mouse. BMC cancer. 10, 363 (2010).
- Bonetto, A., et al. STAT3 activation in skeletal muscle links muscle wasting and the acute phase response in cancer cachexia. PloS One. 6, e22538 (2011).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. Am J Physiol Endocrinol Metab. 303, E410-E421 (2012).
- Bonetto, A., et al. Deacetylase inhibitors modulate the myostatin/follistatin axis without improving cachexia in tumor-bearing mice. Current Cancer Drug Targets. 9, 608-616 (2009).
- Acharyya, S., et al. Cancer cachexia is regulated by selective targeting of skeletal muscle gene products. The Journal of Clinical Investigation. 114, 370-378 (2004).
- Fearon, K., et al. Definition and classification of cancer cachexia: an international consensus. The Lancet Oncology. 12, 489-495 (2011).
- Holecek, M. Muscle wasting in animal models of severe illness. Int J Exp Pathol. 93, 157-171 (2012).
- Acharyya, S., et al. Dystrophin glycoprotein complex dysfunction: a regulatory link between muscular dystrophy and cancer cachexia. Cancer Cell. 8, 421-432 (2005).
- Benny Klimek, ., E, M., et al. Acute inhibition of myostatin-family proteins preserves skeletal muscle in mouse models of cancer cachexia. Biochemical and Biophysical Research Communications. 391, 1548-1554 (2010).
- Pedroso, F. E., et al. Inflammation, organomegaly, and muscle wasting despite hyperphagia in a mouse model of burn cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 199-211 (2012).
- Soda, K., Kawakami, M., Kashii, A., Miyata, M. Manifestations of cancer cachexia induced by colon 26 adenocarcinoma are not fully ascribable to interleukin-6. International journal of cancer. 62, 332-336 (1995).
- Costelli, P., et al. IGF-1 is downregulated in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 291, R674-R683 (2006).
- Palus, S., Akashi, Y., von Haehling, S., Anker, S. D., Springer, J. The influence of age and sex on disease development in a novel animal model of cardiac cachexia. International Journal of Cardiology. 133, 388-393 (2009).
- Norman, K., et al. Effect of sexual dimorphism on muscle strength in cachexia. Journal of Cachexia, Sarcopenia and Muscle. 3, 111-116 (2012).
- Stephens, N. A., et al. Sexual dimorphism modulates the impact of cancer cachexia on lower limb muscle mass and function. Clinical Nutrition. 31, 499-505 (2012).
- Cosper, P. F., Leinwand, L. A. Cancer causes cardiac atrophy and autophagy in a sexually dimorphic manner. Recherche en cancérologie. 71, 1710-1720 (2011).
- Ullman-Cullere, M. H., Foltz, C. J. Body condition scoring: a rapid and accurate method for assessing health status in mice. Laboratory Animal Science. 49, 319-323 (1999).
- Bonetto, A., Andersson, D. C., Waning, D. L. Assessment of muscle mass and strength in mice. Bonekey Rep. 4, 732 (2015).
- Minamoto, V. B., et al. Increased efficacy and decreased systemic-effects of botulinum toxin A injection after active or passive muscle manipulation. Dev Med Child Neurol. 49, 907-914 (2007).
- Murphy, K., Lynch, G. Update on emerging drugs for cancer cachexia. Expert Opin Emerg Drugs. 14, 619-632 (2009).
- Seto, D. N., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. A Key Role for Leukemia Inhibitory Factor in C26 Cancer Cachexia. The Journal of Biological Chemistry. 290, 19976-19986 (2015).
- Judge, S. M., et al. Genome-wide identification of FoxO-dependent gene networks in skeletal muscle during C26 cancer cachexia. BMC Cancer. 14, 997 (2014).
- Kliewer, K. L., et al. Adipose tissue lipolysis and energy metabolism in early cancer cachexia in mice. Cancer Biol Ther. 16, 886-897 (2015).
- Aversa, Z., et al. Changes in myostatin signaling in non-weight-losing cancer patients. Ann Surg Oncol. 19, 1350-1356 (2012).
- Bonetto, A., et al. Early changes of muscle insulin-like growth factor-1 and myostatin gene expression in gastric cancer patients. Muscle Nerve. 48, 387-392 (2013).
- Lazarus, D. D., et al. A new model of cancer cachexia: contribution of the ubiquitin-proteasome pathway. The American Journal of Physiology. 277, E332-E341 (1999).
- al-Majid, S., McCarthy, D. O. Resistance exercise training attenuates wasting of the extensor digitorum longus muscle in mice bearing the colon-26 adenocarcinoma. Biol Res Nurs. 2, 155-166 (2001).
- Bonetto, A., et al. JAK/STAT3 pathway inhibition blocks skeletal muscle wasting downstream of IL-6 and in experimental cancer cachexia. American journal of physiology. Endocrinology and metabolism 303. 303, E410-E421 (2012).
- Samuels, S. E., et al. Liver protein synthesis stays elevated after chemotherapy in tumour-bearing mice. Cancer Lett. 239, 78-83 (2006).
- Cornwell, E. W., Mirbod, A., Wu, C. L., Kandarian, S. C., Jackman, R. W. C26 cancer-induced muscle wasting is IKKbeta-dependent and NF-kappaB-independent. PloS One. 9, e87776 (2014).
- Penna, F., et al. Muscle wasting and impaired myogenesis in tumor bearing mice are prevented by ERK inhibition. PloS One. 5, e13604 (2010).
