El Colon-26 Carcinoma portadores de tumores de ratón como modelo para el estudio del cáncer de caquexia

Summary

Mice bearing the Colon-26 (C26) carcinoma represent a classical model of cancer cachexia. Progressive muscle wasting occurs in association with tumor growth, over-expression of muscle-specific ubiquitin ligases, and reductions in muscle cross-sectional area. Fat loss is also observed. Cachexia is studied in a time-dependent manner with increasing severity of wasting.

Abstract

Cancer cachexia is the progressive loss of skeletal muscle mass and adipose tissue, negative nitrogen balance, anorexia, fatigue, inflammation, and activation of lipolysis and proteolysis systems. Cancer patients with cachexia benefit less from anti-neoplastic therapies and show increased mortality¹. Several animal models have been established in order to investigate the molecular causes responsible for body and muscle wasting as a result of tumor growth. Here, we describe methodologies pertaining to a well-characterized model of cancer cachexia: mice bearing the C26 carcinoma^2-4. Although this model is heavily used in cachexia research, different approaches make reproducibility a potential issue. The growth of the C26 tumor causes a marked and progressive loss of body and skeletal muscle mass, accompanied by reduced muscle cross-sectional area and muscle strength^3-5. Adipose tissue is also lost. Wasting is coincident with elevated circulating levels of pro-inflammatory cytokines, particularly Interleukin-6 (IL-6)³, which is directly, although not entirely, responsible for C26 cachexia. It is well-accepted that a primary mechanism by which the C26 tumor induces muscle tissue depletion is the activation of skeletal muscle proteolytic systems. Thus, expression of muscle-specific ubiquitin ligases, such as atrogin-1/MAFbx and MuRF-1, represent an accepted method for the evaluation of the ongoing muscle catabolism². Here, we present how to execute this model in a reproducible manner and how to excise several tissues and organs (the liver, spleen, and heart), as well as fat and skeletal muscles (the gastrocnemius, tibialis anterior, and quadriceps). We also provide useful protocols that describe how to perform muscle freezing, sectioning, and fiber size quantification.

Introduction

La atrofia muscular es una complicación grave de diversas condiciones clínicas tales como el cáncer, sepsis, hígado, cirrosis, insuficiencia cardíaca y renal, enfermedad pulmonar obstructiva crónica, y el SIDA. En particular, el desgaste muscular es evidente en al menos 50% de los pacientes con cáncer de ^1. La pérdida de músculo esquelético en el cáncer resulta de una mayor degradación de las proteínas debido a la sobre-activación de los sistemas proteolíticos del músculo esquelético y / o de disminución de la síntesis de proteínas ^6. La lipólisis es también evidente, lo que lleva a la disminución de tejido adiposo. Clínicamente, la caquexia está asociada con una reducción de la calidad y la duración de la vida y se estima que es la causa de la muerte en 20 – 30% de los pacientes de cáncer de ^7. El uso de modelos experimentales que se asemejan a la enfermedad humana tan estrechamente como sea posible sería beneficioso. Un modelo animal óptima se caracteriza por una alta reproducibilidad, así como por la interferencia limitada de diferentes terapias y los factores impredecibles dela dieta, el sexo y los antecedentes genéticos que se asocian generalmente con la condición clínica ^8. Hasta el momento, la caquexia del cáncer se ha estudiado principalmente en modelos animales que se caracterizan por el trasplante de células de cáncer o de inyección de carcinógenos, aunque un nuevo método es el uso de ratones modificados genéticamente susceptibles al desarrollo de cáncer.

Los ratones que llevan el carcinoma C26 (también referidos como de colon-26 y adenocarcinoma) representar un modelo bien caracterizado y utilizado ampliamente de la caquexia del cáncer de ^2,5. El crecimiento de los resultados C26 tumorales en el cuerpo y la pérdida de peso muscular, principalmente mediante el aumento de la grasa y el catabolismo proteico ^9. Generalmente, un peso del tumor 10% versus el peso corporal total se asoció con una reducción de 20-25% en peso del músculo esquelético y un mayor agotamiento de la grasa ^{de 3,10.} Hepatomegalia y esplenomegalia también se observan con el crecimiento tumoral, junto con la activación de la respuesta de fase aguda y la elevación de pro-inflalos niveles de citoquinas mmatory ^3,11. Entre estos, se sabe que la IL-6 juega un papel fundamental en la mediación de pérdida de masa muscular en el modelo C26, a pesar de que esta citocina no es probablemente el único inductor de caquexia ^12. Elevada IL-6 causa atrofia muscular a través de la activación de la vía de JAK / STAT3, y la inhibición de este factor de transcripción puede prevenir atrofia muscular ^3,4.

Durante pérdida de masa muscular inducida por C26, como en muchas condiciones de atrofia muscular, la masa muscular se pierde en gran medida a través de reducciones en el contenido de proteína del músculo a través de las fibras musculares, no a través de la muerte celular o pérdida de fibras ^13. En C26 caquexia, un cambio hacia áreas de sección transversal más pequeñas se observa tanto en glucolíticas y oxidativas fibras ^2. Esto también es coherente con una reducción de la fuerza muscular ^5. Muchos grupos de todo el mundo han aprovechado el modelo C26 con el fin de descubrir nuevos mediadores de la pérdida de masa muscular o fármacos clínicamente relevantes para el cáncer cacHexia. Sin embargo, se ha informado de muchos procedimientos diferentes para el uso de este modelo, aumentando las preocupaciones acerca de la consistencia de los datos obtenidos y que presenta obstáculos al reproducibilidad en diferentes condiciones experimentales. Aquí mostramos un uso típico de este modelo para el estudio de la caquexia por cáncer que produce datos estandarizados y reproducibles.

Protocol

Declaración de Ética: Todos los estudios descritos fueron aprobados por los Comités de Cuidado y Uso de Animales Institucional de la Universidad Thomas Jefferson y la Escuela de Medicina de la Universidad de Indiana. 1. C26 crecimiento celular y Preparación Obtener células de cáncer colorrectal C26 (Universidad Estatal de Ohio Medical Center (OSUMC)) y preparar el medio de crecimiento completo (es decir, alta glucosa de Dulbecco Modificado de Eagle Medium (DMEM) que…

Representative Results

C26 cinética de crecimiento de tumores muestran una fase de latencia para la primera 7-8 d después de la inyección, seguido por un crecimiento celular exponencial (4-5 d). La masa tumoral llega finalmente ~ 10% del peso corporal (alrededor de 2 g; Figura 1A-B). Durante la primera fase, el tumor puede ser localizado por palpación solamente y aparece como una pequeña protuberancia de la piel. En la segunda fase, el tumor se observa como una masa bajo …

Discussion

Especialmente en sus últimas etapas, el cáncer colorrectal se asocia con el desarrollo de la caquexia, que es responsable de los resultados y las reducciones en la calidad de vida del paciente más pobres. Muchos estudios se han centrado en el tratamiento de condiciones secundarias al cáncer; Sin embargo, a pesar de muchos esfuerzos en este sentido, aún no existe una terapia aprobada para la caquexia por cáncer ^21. Por lo tanto, es imperativo que los modelos animales se asemejan a la patología humana ta…

Materials

Cell culture Flasks	Falcon – Becton Dickinson	35-5001
DMEM	Cellgro	10-017-CV
FBS	Gibco	26140
Streptomycin-Penicillin	Cellgro	30-002-CI
CD2F1 mice	Harlan	060
Anesthesia apparatus	EZ-Anesthesia	EZ-7000
2-Methyl Butane	Sigma-Aldrich	M32631
OCT	Tissue-Tek	4583
Cryostat	Leica	CM1850
Cork disks	Electron Microscopy Sciences	63305
Superfrost plus glass slides	VWR	48311-703
Anti-Laminin Rabbit polyclonal antibody	Sigma-Aldrich	L9393
Anti-Dystrophin Mouse Monoclonal antibody	Vector Laboratories	VP-D508
Alexa Flour 594 anti-mouse IgG	Life Technologies	A11062
Alexa Flour 594 anti-rabbit IgG	Life Technologies	A21211
Hematoxylin	Sigma-Aldrich	GHS216
Eosin	Sigma-Aldrich	HT110332
Xylene	Acros Organics	422680025
Cytoseal-XYL	Thermo	8312-4
Microscope	Zeiss	Observer.Z1
Bamboo Tablet	Wacom	CTH-661
Prism 7.0 for Mac OS X	GraphPad Software, Inc.
Excel for Mac 2011	Microsoft Corp.
Image J	US National Institutes of Health	IJ1.46	http://rsbweb.nih.gov/ij/download.html
Microtainer	BD	365873