定量微中和试验的优化

Summary

这项研究描述了一个 成像基于微中和测定来分析病毒之间的抗原关系。该协议采用平板扫描仪，有四个步骤，包括滴定，滴定定量，中和，中和定量。该法与目前流行的流感A（H1N1）pdm09，A（H3N2）和乙型流感病毒效果很好。

Abstract

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

Introduction

微中和（MN）测定法在病毒学用于中和抗体的定量和的抗病毒活性。作为血凝抑制的替代（HI）测定，MN测定法可以克服由受体结合于流感病毒的亲和力的改变，其可以变得复杂的HI的解释结果^1,2,3-影响无抗原性的影响。直到最近，大多数MN测定法基于细胞病变效应（CPE）或酶联免疫吸附测定^{（ELISA）4,5。}根据焦点和斑块减少MN试验于1990年^6,7,8开发的。噬斑减少测定依赖于计数可见斑量化感染。然而，视觉计数仅覆盖大斑是由人眼可分辨的，尽管大多数斑很小，对于许多当前流行的病毒不可见的。这种不完整的覆盖面可能会导致考官之间和实验之间显著的变化，导致我ncomparable结果。另外，也不能使用该方法时，一些病毒表明单个细胞或非常小的斑块流产感染。

计数分辨率差可以通过引入基于成像的协议来改进。随着技术，光学显微镜和高通量的进步孔板读者可以提供准确的方法来计算感染的细胞^9。下一个反式照明显微镜，具有标记某些标记感染的细胞可以通过在亚细胞分辨率的吸收或荧光对比度可视化。样品然后可以在电脑屏幕上进行分析。

不幸的是，由于在视场的限制，超过一百平铺图像，需要以覆盖单个孔。判断的板96孔将需要一万左右的图像的摄像处理。这种费力的过程是耗时和昂贵的，并且所获得的分辨率是在属升不必要对病毒感染的常规鉴定。预算有限的实验室可能会发现周围的平板扫描仪内置的方法提供了一种高性价比，高通量的选择。

在本文中，我们描述一种改进的空斑减少测定法MN是适合于大量的病毒的抗原特征和用于定量测定抗病毒活性和中和抗体。该试验具有几个优点：第一，它是一个基于成像的检测，能够测量在细胞水平的病毒感染，无论斑块大小的。内一个井计数总感染的细胞群（ICP）大大增加了检测灵敏度，使得有可能以低感染性表征病毒。其次，更准确地定量滴定之前中和引入到确定输入病毒的量。量化输入病毒显著降低杂物不同的实验之间化，使结果实验室之间更具可比性。第三，中和滴度可以直接通过分析图像，使得定量快速和方便用户的确定。最后，该协议提供了一种具有成本效益和高通量的替代与所需的分辨率和精度。定量是基于一个平板扫描仪和免费数据处理软件。整个安装占地面积小，是大多数实验室部署。

本文提出的协议包括四个主要步骤，包括病毒滴定法，滴定定量，病毒中和，中和定量。病毒滴定是制备实验确定在中和中使用的输入病毒的量。期间滴定，一些病毒浓度在一个96孔板施加到细胞单层。被感染的细胞，然后在第2，病毒定量DILU化，产生20％-85％ICP被依次施加作为输入病毒到相应的中和 第3节中和协议的效价是使用第4节实验证明遵循上述协议是在代表结果提出量化。该法已在过去两年，大多数目前流行的流感病毒，如A（H1N1）pdm09，A（H3N2）和乙型流感病毒彻底的测试。流感病毒鉴定结果已列入给了流感疫苗南半球在2016年和北半球2016至2017年使用建议世界卫生组织协商会议的报告。

Protocol

注：以下协议的生物安全水平（BSL）是季节性流感病毒和BSL 3+为潜在的流感大流行的病毒BSL 2。病毒滴定法需要事先中和实验来决定病毒控制（VC）的病毒浓度。 1.病毒滴度注意：根据病毒的数量和重复的次数，一孔板可以设置具有以下灵活性：（1）病毒稀释可以沿任一的行或列（ 图1）被布置。每个病毒应该占据一个独立的行/列。 （2）病毒稀释增量是柔性的，但它应与在左上角的最高病毒浓度开始。 （3）上有重复的数量没有限制。 注：的Madin Darby狗肾细胞（MDCK）和MDCK-SIAT1（SIAT）细胞好心由M. Matrosovich博士，马尔堡，提供芨芨草许多10。盟细胞是与人的CMP-N-乙酰神经氨酸稳定转染的MDCK细胞：唾液酸（SA）的增强表达β半乳糖苷α-2,6-唾液酸转移酶基因α2-6Gal终止寡糖。 等分部分足以MDCK细胞或MDCK-盟细胞8到96孔板（200μl/孔）。孵育细胞在37℃，5％CO 2的2或3天以达到融合。传播补充有10％热灭活胎牛血清（FCS）和抗生素（100U / ml青霉素和100μg/ ml链霉素）的DMEM细胞。孵育盟细胞在37℃，5％的CO 2和1mg / ml G418的硫酸盐。 注：稀释倍数取决于经验和所使用的细胞系。细胞单层必须汇合（即没有细胞壁或MDCK细胞和MDCK-SIAT1细胞紧密堆积布局可见轮廓）在病毒接种时。稀释液的例子基于MDCK或MDCK-SIAT1细胞汇合烧瓶的传代培养于表1中给出。 清洗细胞3次，用200微升每孔病毒生长培养基（VGM）的。消毒用70％乙醇的多层洗板30分钟，然后冲洗在洗涤前的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）或VGM。 吸出VGM，立即加入50微升VGM的每个孔中。 添加900微升VGM到每个6无菌试管中（或更少，这取决于测试的病毒和重复数）。吸取100微升病毒进入第一管，拌匀，并连续稀释，改变每个稀释度之间的提示。重复每个病毒滴定。 注意：这将给予10 -1病毒稀释至10-6。 添加每种病毒稀释液50微升，起始于最高稀释度（1×10 -5 图1），在9重复的孔中（列9和10中的图1）6孔板中。 放置在37℃的板2-3小时以使病毒感染的细胞。 注：A 2至3小时培养是必要的，以确保在接种病毒有足够的时间来达到单层。 准备覆盖（10毫升/板） 注意：覆盖由5毫升的2×DMEM，胰蛋白酶（2微克/毫升的最终浓度），20微升的1毫克/毫升的库存，和5ml纤维素棉短绒（见材料清单）的。 取出接种。 加覆盖（200微升至每孔）。在37℃孵育过夜的，不受干扰。 注：病毒出芽发生之后大约4小时，因此重要的是，该板未在此时间后的干扰。 吸从井中覆盖。 加入冰冷的4％多聚甲醛的PBS（200微升/孔）。将它们放置在4℃下30分钟，或在室温下搅拌20分钟。 注：PBS A是自然pH值的磷酸盐缓冲盐水，10去˚F氯化钠0.25g的氯化钾，1.437克的 Na 2 HPO 4的0.25g的KH 2 PO 4，1升蒸馏水（见材料清单）。 注意：吸入和吞食可能造成灼伤时，多聚甲醛是有害的。还有具有致癌作用的证据有限，和皮肤接触后可能会引起过敏。 吸出多聚甲醛，并用PBS洗涤板两次（200μl/孔）。 存储在PBS A中的板在4℃下以供将来使用，或与下列步骤进行。 添加透化缓冲液（100μl/孔）。离开它在室温下30分钟。 用PBS洗两次板（200微升/孔）。 加入50微升一抗，抗流感A型鼠标单克隆抗体（1：1,000 ELISA缓冲液），每口井。孵育它在室温下1小时（或4℃过夜），在摇动。 在100μl洗涤缓冲液（0.05％吐温80在PBS中A，V / V）的p洗3次呃好。孵育它在室温下洗涤之间5分钟。另外，洗3次，而无需使用每孔300微升孵化。 加入50μl的第二抗体的山羊抗小鼠IgG（H + L）HRP缀合物（1：1000在ELISA缓冲液），每孔。孵育它在室温下搅拌1小时，用摇动。 如在步骤1.17中所述洗3次。 添加底物（50μl/孔）。孵育，在室温下30分钟或直至蓝色的发展是清晰可见。 停止反应，用200μl每孔蒸馏水洗涤平板两次，在室温下温育的洗涤之间2 -3分钟。 空气干燥板，并将其存储在一个黑暗的地方（ 例如，包装在铝箔）。 2.定量滴定放置在平板扫描仪的扫描区一个孔板， 如图2a所示。使用L形的位置限制确保最佳的和可重复的成像位置。 注意：可以将图像两个著名板在一次扫描。 扫描图像。 注：设置示于表2中 。 运行“多孔板阅读器”的软件来计算所需的病毒浓度（ 图3）。 点击“加载图像”按钮，加载图像。滑入“全球阈值”选项卡以调整采样阈值直方图的红条。点击“更新”按钮来检查图像上的效果。 勾选“计算中和/滴定”框。点击“采集”按钮以量化的ICP。点击“保存”按钮，在出现提示时保存采样结果。 注：在采样过程后，如果“计算中和/滴定”框中打勾自动出现一个名为“中和滴定与计算”新窗口。 负载或输入井板定义地图。表明在“滴定：最优病毒种群（％）”的阈值（ 例如，30％）。选择“滴定进程”选项卡来计算滴定结果。检查滴定结果。点击“保存并关闭”按钮，保存滴定结果。 注：请参阅补充S1有关软件的详细说明。可根据要求定制的软件的副本。 注：通常，最好的病毒稀释度为50％左右（20-85％）细胞总数的ICP斑块还原法产量每孔11之内。 3.病毒中和注：计算的中和测定所需板的数量。每个板可容纳一个病毒和一些抗血清。 注意：根据抗血清的数量和重复的次数，一孔板可以设置与第Ë以下灵活性：（1）血清稀释度可以沿任一行或一列（ 图4）被布置。每个血清应该占据一个独立的行或列。 （2）血清稀释度的增量是柔性的，但它应与在板的左上角的最高血清浓度开始。 （3）重复的数量平衡的抗血清的数量。更多的重复可以帮助理顺实验的变化。 （4）在VC的数量和单元控制（CC）的重复是柔性的，但它们也应该是在单独的行或列的数目。据预计，VC副本的数目比抗血清的显著更大。 制备细胞单层，如在步骤1.1-1.3，2或3天提前。 加入50μlVGM的至板的各孔中。 分别用11和12列的VC和CC。添加1:20受体破坏酶（RDE）处理血清的50微升等分试样到科拉姆的第一行（A）的NS 1-10。 注：对于每种病毒和血清结合，该试验一式两份进行，从而一个板可，例如，包含一种病毒对五种抗血清进行测试。 执行从A行从行H.转移50微升到行H（列1-10 图4），并丢弃50微升2倍系列稀释加入50μl稀释液向CC柱（ 图4中第12列）的各孔中。 加入50μl病毒至板的各孔中，除了用于CC柱（列1-11，行AH中图4）。 孵育它在37℃下2-3小时。取出接种。加覆盖（200微升）到每个孔中。过夜孵育它在37℃下，原状。修复和染色板作为病毒滴度（步骤1.11-1.22）。 4.中和定量放置一个孔板在平板扫描仪的扫描区，如图Figu重新2A。使用L形位置的限制，以保证最佳的和可重复的成像位置。 注意：可以将图像两个著名板在一次扫描。 扫描板，如在步骤2.2中描述。 运行“多孔板阅读器”的软件来计算所需的病毒滴度（ 图3，步骤2.3）。 点击“加载图像”按钮，加载图像。滑动“全球阈值”的红色条及时调整采样阈值。点击“更新”按钮来检查的效果。 勾选“计算中和/滴定”框。点击“采集”按钮以量化的ICP。点击“保存”按钮，在出现提示时保存采样结果。 注：在采样过程后，如果“计算中和/滴定”框中打勾自动出现一个名为“中和滴定与计算”新窗口。 负载或输入井-P晚地图。指示阈值（ 例如，50％）“中和：感染扣除（％）”。 选择“中和过程”来计算的滴度。检查滴度，并点击“保存并关闭”按钮，保存中和结果。 注：中和被报告为与预定的ICP还原（如50％或80％）对在VC（11栏的图4中的平均值）的血清的最高稀释度的倒数。 50％的减少ICP是在代表性的成果使用。

Representative Results

经上述程序，我们提出最近的抗原特性的实验的一些结果。滴定设置旨在探讨八个输入病毒，与每个稀释度双重复。病毒稀释液进行试验1.0和1.0之间×10 -1×1.0 -6覆盖病毒之间的变化。测试病毒是由H3N2亚型，包括A /喀麦隆/ 15V-二千〇一十五分之三千五百三十八，A /符拉迪沃斯托克/ 36/2015年，A /莫斯科/ 103/2015年，A /托木斯克/ 5/2015 /，A /莫斯科/ 101 / 2015，A /莫斯科/ 100/2015，A /莫斯科/ 133/2015和A /布拉迪斯拉发/ 437/2015。滴定结果示于图5中示出。 图5d说明了的ICP的病毒稀释度的增加而减少。曲线进行归针对的一个井12内产生的所有小区感染同一病毒的ICP（定义为ICP饱和度）。如果ICP并没有随着喜达到饱和ghest病毒浓度，从相应的重复平均ICP代替（A /莫斯科/ 103/2015 图5d）。所产生ICP饱和的30％的病毒稀释液被选择作为输入的病毒稀释度中和（ 表3）。 中和的目的是有一个输入病毒对五种抗血清，对每个板双重复。所示的基准病毒是H3N2 A /斯德哥尔摩/ 63/2015五个抗血清A / HK14分之4801蛋F12 / 15，A / HK十四分之七千二百九十五MDCK F02 / 15，A /南非R2665 / 15 SIAT F50 / 15，A /瑞士十三分之九百七十一万五千九百二十三SIAT NIBF F18 / 15，和A /荷兰十四分之五百二十五SIAT F23 / 15。中和的结果在图6中示出。 图6d示出了具有血清稀释度的增加的感染的进展。在垂直轴上的归一化阳性群体代表的ICP的从对平均ICP相应的抗血清反应的比率的基准病毒12。未感染细胞对照背景ICP正常化过程中扣除。中和滴度被确定为对应于50％的ICP降低（ 表4）的抗血清稀释液的倒数。线性内插来估计滴度两个相邻的血清稀释度之间落下。 图1： 在病毒滴定实验一孔板设置举例。测试病毒被分配到不同的行（A至H）。列是针对不同的病毒稀释液（1到12）。两列被用作复制每个病毒稀释。比例尺= 10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 <p class="jove_content" fo:kee对 – together.within页="“1”"> 图2： 样品扫描系统的原理图。 （a）在平板扫描仪的成像位置A 96孔板（从再版 附图11用从爱思唯尔BV许可），和（b）中所示的L形位置极限尺寸（一）。 请点击此处查看该图的放大版本。 图3：“多孔板阅读器”定量软件的台式图。 请点击此处查看该图的放大版本。 </p> 图4： 在中和实验中孔板设置举例。各抗血清被分配给两列重复（1〜10）。行针对不同的血清稀释（A至H）。该病毒控制需要11列，有八个重复（A11至H11）。小区控制是在第12栏，有八个重复（A12至H12）。比例尺= 10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 图5：滴定实验的结果。 （ 一 ）该井板设置，（ 二 ）扫描孔板图像，（C）说明的颜色编码的，定量，病毒感染的细胞群，和针对病毒稀释液（D）的归一化的病毒感染的细胞群。 30％的ICP用作阈值。 （d）中的误差棒是从样品重复（±1 SD）标准差（SD）。的（b）和（c）比例尺= 10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 图6： 中和试验的结果。 （ 一 ）该井板设置，（ 二 ）扫描孔板图像，（c）该定量，病毒感染的细胞群的画像，和对血清稀释度（D）的归一化的病毒感染的细胞群。输入VIRUS（VC）是A /斯德哥尔摩/ 63/2015 50％的ICP来计算滴度。 （d）中的误差棒是从样品重复（±1 SD）标准差（SD）。的（b）和（c）比例尺= 10毫米。 请点击此处查看该图的放大版本。 补充S1： 请点击这里下载该文件。 典型的稀释 MDCK细胞 MDCK-SIAT1细胞 2天 1：5（1 + 4） 1:10（1 + 9） 3天 </td> 1:10（1 + 9） 1:20（1 + 19） 每ml细胞的典型数 MDCK细胞 MDCK-SIAT1细胞 2天 2×10 5个 1×10 5个 3天 1×10 5个 5×10 4 表1：MDCK或MDCK-SIAT1细胞融合瓶的亚文化的典型稀释。 模式专业模式文件类型膜（该片区指南） 自动曝光类型照片 IM年龄类型 24位彩色解析度 1200 DPI 保存的图像格式 TIFF 表2：平板扫描仪的典型设置。 行 病毒 建议稀释 一个 A /卡梅伦/ 15V-二千〇一十六分之三千五百三十八 1.0×10 -2 乙 A /符拉迪沃斯托克/2015分之36 1.0×10 -3 C A /莫斯科/二千〇一十五分之一百〇三 1.1×10 -1 ð A /托木斯克/二千〇一十五分之五 5.9×10 -1 Ë A /莫斯科/二千〇一十五分之一百〇一 8.3×10 -1 F A /莫斯科/二千零十五​​分之百 1.4×10 -2 G A /莫斯科/二千〇一十五分之一百三十三 1.3×10 -2 H A /布拉迪斯拉发/二千〇一十五分之四百三十七 1.3×10 -4 表3：从30％ICP的人口计算的病毒稀释液。 柱 抗血清 推荐滴度 1 – 2 A / HK4801 / 2014 110 3 – 4 A / HK7295 / 2014 213.3 <td> 5 – 6 A /南非/ R2665 / 2015 2155.8 7 – 8 A /瑞士/二千〇一十三分之九百七十一万五千二百九十三 89.4 9 – 10 A /荷兰/二千〇一十四分之五百二十五 78.6 表4：A /斯德哥尔摩的50％ICP /二千零十五分之六十三反对抗血清滴度。

Discussion

在这项研究中，我们所描述的基于成像的MN测定以量化病毒之间的真实抗原关系。与其它噬斑减少测定法相比，该方法强调测量整个井的ICP，确保感染人口的完全覆盖。其斑块形成的独立性也加宽了测定，以能够形成主要隐形小斑块或只能管理单细胞感染病毒的应用。因此，该测定能够检查更多的病毒和更宽范围的抗体比HI的的影响，并且它有助于更全面地反映抗原相似或病毒¹²之间的差异。例如，当包括奥塞米韦羧酸盐中，MN测定较少受NA依赖性影响结合，反映抗原的差异更准确。在测定法的发展，大作出了努力以提高实验一致性，速度和检测敏感性，包括通过定量滴定，成像高通量与平板扫描仪输入控制病毒，并实现用户友好的数据处理平台。结果一般都符合并证实了这些HI的。值得注意的是，调查结果还显示所造成的文化选择的或偶发性的变化抗原性改变近期A和B型疫苗病毒抗原漂移变体之间抗原的差异，以及，如在某些A（H1N1）pdm09病毒HA1的G155E替换^12。

该协议与相匹配的，给了最强的感染，这大大提高了成像信号的细胞系的选择病毒类型或亚型。实验变异用与测试抗血清的数量平衡重复的设计平滑。的不确定性也可以来自图像质量，这主要是由成像设备的影响。一个体面的彩色平板扫描仪可以显ficantly提高图像的对比度和降低噪音。输入病毒的中和量必须提前定量测定从相应的滴定而病毒仍然保持相似的状态。期间中和，抗血清反应的感染是针对基准病毒（VC）和背景水平（CC）之间的差归一化。 VC和CC的精确测量是中和实验必不可少的。建议更多的重复（一式八份分别在代表性的成果使用）。最后，了解软件是一个实验的成功至关重要。该软件已经过测试，在世卫组织流感中心，英国常规病毒特征进行了两年多。用于处理各种情况的详细说明在补充S1中提供的。

该MN测定法是适合于将样品覆盖一个电话分机的应用remely大视场，但只需要适度的成像分辨率。低成本和简单的设置，使系统随时提供给最病毒学实验室。在相同样品的测量结果的变化小于3％，这大致定义了扫描¹¹中引入的不确定性。这种重复性是在许多病毒学研究的足够，并且可以通过平均从多个扫描图像来进一步降低。

总之，这项研究表明，在抗原性研究中经常使用，并支持目前流通的流感病毒，特别是对病毒列入人类流感疫苗的一年两次的选择详细的分析数据HI强大MN检测。

Materials

VGM	Sigma	D6429, P0781	500 ml DMEM+5 ml Pen/Strepb
PBS A			Nature pH Phosphate-buffered saline: NaCl -10 gm, KCl – 0.25 gm, Na2HPO4 – 1.437 gm, KH2PO4 – 0.25 .gm, and Dist. Water – 1 L.
Avicell	FMC	RC-581F	2.4g in 100ml distilled water dissolved by agitation on a magnetic stirrer for 1 hr. Sterilize by autoclaving.
2XDMEM	Gibco	21935-028
Trypsin	Sigma	T1426
Overlay (10ml/plate):			5ml 2X DMEM, Trypsin 2μg/ml final conccentration,Avicell  – 5ml
Triton X- 100e	Sigma	T8787	Permeabilisation buffer: 0.2% in PBS A (v/v)
Tween 80	Sigma	P5188	Wash Buffer: 0.05% Tween – 80 in PBS A (v/v)
Horse serum	PAA Labs Ltd	B15-021	ELISA Buffer: 10%  in PBS A (v/v) + 0.1% Tween 80
Mouse MAb against influenza type A	Biorad	MCA 400	1st Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer
Goat anti-mouse IgG (H+L) HRP conjugate	Biorad	172-1011	2nd Antibody: 1:1000 in ELISA Buffer
True Blu peroxidase substrate	KPL	50-78-02	Substrate:  True blue +0.03% H2O2g (1:1000 of 30% solution)
96-well flat-bottom microtitre plates	Costar	3596
8 channel multiwall-plate washer and manifold	Sigma	M2656
Perfection Plate Scanner	Epson	V750 Pro	The imaging software can be downloaded freely from http://www.epson.com/cgi-bin/Store/support/supDetail.jsp?oid=66134&infoType=Downloads.
Software operational environment: LabVIEW	National Instruments Corporation	Window based with NI Vision builder	Version: LabVIEW2012 or above