Studie av endoplasmatiskt retikulum och Mitochondria Interaktioner av<em> In Situ</em> Proximity Ligation Assay i fixerade celler

Summary

Här beskriver vi ett förfarande för att visualisera och kvantifiera med hög känslighet de endogena interaktioner mellan det endoplasmatiska retiklet och mitokondrier i fixerade celler. Protokollet har en optimerad in situ närhet ligering analys med inriktning på inositol 1,4,5-trifosfat receptor / glukos-reglerad protein 75 / spänningsberoende anjon kanal / cyklofilin D komplexet vid mitokondrierna associerade membran gränssnitt.

Abstract

Structural interactions between the endoplasmic reticular (ER) and mitochondrial membranes, in domains known as mitochondria-associated membranes (MAM), are crucial hubs for cellular signaling and cell fate. Particularly, these inter-organelle contact sites allow the transfer of calcium from the ER to mitochondria through the voltage-dependent anion channel (VDAC)/glucose-regulated protein 75 (GRP75)/inositol 1,4,5-triphosphate receptor (IP3R) calcium channeling complex. While this subcellular compartment is under intense investigation in both physiological and pathological conditions, no simple and sensitive method exists to quantify the endogenous amount of ER-mitochondria contact in cells. Similarly, MAMs are highly dynamic structures, and there is no suitable approach to follow modifications of ER-mitochondria interactions without protein overexpression. Here, we report an optimized protocol based on the use of an in situ proximity ligation assay to visualize and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells by using the close proximity between proteins of the outer mitochondrial membrane (VDAC1) and of the ER membrane (IP3R1) at the MAM interface. Similar in situ proximity ligation experiments can also be performed with the GRP75/IP3R1 and cyclophilin D/IP3R1 pairs of antibodies. This assay provides several advantages over other imaging procedures, as it is highly specific, sensitive, and suitable to multiple-condition testing. Therefore, the use of this in situ proximity ligation assay should be helpful to better understand the physiological regulations of ER-mitochondria interactions, as well as their role in pathological contexts.

Introduction

Mitokondrier och endoplasmatiskt retikulum (ER) inte är självständiga organeller i cellen, men de interagerar strukturellt och funktionellt vid kontaktställen som definieras som mitokondrier associerade endoplasmatiska retiklet membran (MAM). I själva verket mams motsvarar regioner där membranen i ER och mitokondrier är nära apposed, så att interaktioner mellan proteiner från båda sidor. Ändå gör membranen i dessa organeller inte smälter inom dessa områden, så att de behåller sina separata enheter. De mams spelar en avgörande roll i kalcium (Ca2 ⁺⁾ och fosfolipid överföring från ER till mitokondrierna, påverkar energimetabolism och cellöverlevnad ^1-3.

Sambandet mellan ER och mitokondrier först visualiseras på 1970-talet med elektronmikroskopi. Sedan dess transmissionselektronmikroskopi ^4,5 elektron tomografi ^6,7 eller immun lokalisering av ER och mitokondrier specifika fluoroforens / fluorescerande proteiner ⁸ var klassiskt använts för att studera ER-mitokondrier interaktioner. En annan användbar verktyg för analys av MAM är baserad på användningen av subcellulär fraktionering. Den tillåter isolering av MAM fraktioner genom differentiell ultracentrifugering kopplad till en Percoll gradient ^9. Men innehåller slutprodukten anrikade MAM fraktioner, snarare än rena fraktioner. Helt och hållet, är dessa strategier inte särskilt känsliga och / eller kvantitativ, och de är inte lätta att stora screening. Alternativt har genetiska tillvägagångssätt med läkemedels inducerbar fluorescerande interorganell linkers framkommit, men de tillåter inte analysen av organell interaktion på endogena expressionsnivåer av proteiner ^10.

Baserat på Szabadkai upptäckt av IP3R / GRP75 / VDAC komplexet vid MAM ^11, utvecklade vi en kvantitativ metod för att analysera ER-mitokondrier interaktioner. Vi använde in situ närhet ligatipå analys för att detektera och kvantifiera interaktioner mellan VDAC1 och IP3R1, två organell-ytproteiner som är inblandade i Ca ^{2 +} -channeling komplexet vid MAM-gränssnittet i fixerade celler ^12. I korthet sonde vi VDAC1 vid den yttre mitokondriemembranet (mus-anti-VDAC1 primär antikropp) och IP3R1 vid ER-membranet (kanin-anti-IP3R1 primär antikropp) (figur 1, fält A). Sedan, enligt analysen, tillsatte vi både anti-mus- och anti-kanin IgG (mus och kanin närhet ligering analyssonder), som är konjugerade till komplementära oligonukleotid-förlängningar. Om de två riktade proteinerna är på ett avstånd under 40 nm, kan oligonukleotiderna hybridisera med anslutnings oligos därefter tillsatta för att tillåta bildningen av en cirkulär DNA-mall (Figur 1, panel b). Detta cirkulär DNA-molekyl ligeras och förstärks, vilket skapar en enda DNA-produkt kovalent fäst till en av närhetssonder (Figur 1, panel C) </strong>. Eftersom avståndet mellan ER och mitokondrier vid MAM gränssnittet varierar från 10 nm till 25 nm ^6, närhet ligering och amplifiering kan ske, vilket leder till efterföljande detektering på grund av hybridisering av Texas Red-märkta oligonukleotidprober (fig 1, panel D ). Varje fluorescerande prick representerar interaktioner mellan VDAC1 / IP3R1, vilket möjliggör kvantifiering av in situ ER-mitokondrier interaktioner i enskilda celler.

Figur 1: Schematisk illustration av detektion av det endoplasmatiska retiklet-mitokondrier interaktioner med In Situ Proximity Ligation Assay. a) En mus primär antikropp riktad mot VDAC1 och en kanin primär antikropp riktad mot IP3R1 kan binda till deras epitoper i närhet vid MAM gränssnitt, b) Tillsats av ett par av närhets ligerings proberriktat mot mus och kanin-IgG. Dessa sönder har fäst DNA-strängar som kan bilda mallar för ligeringen av anslutnings oligos. c) Det cirkulära DNA-strängen som bildas efter ligation kan förstärkas och d) visualiseras genom mikroskop som en fluorescerande prick med Texas Red-märkta oligonukleotider. Klicka här för att se en större version av denna siffra.

Liknande in situ närhet ligerings analysexperiment kan utföras med GRP75 / IP3R1 par av antikroppar, såväl som cyklofilin D (CypD) / IP3R1 antikroppar, med tanke på att CypD visades interagera med IP3R / GRP75 / VDAC komplexet vid MAM gränssnittet ^12-14.

Protocol

1. Beredning av lösningar Förbered 10% formaldehyd i PBS (låg salthalt) genom att späda 5,5 ml av 37% formaldehyd i 14,5 ml PBS. Förbereda en M glycin, pH 8,0, genom att lösa upp 3,8 g glycin i 50 ml PBS; Späd denna lösning för att erhålla 100 mM glycin i 1x PBS. Bered 0,1% Triton-X100 i 1x PBS. Förbereda 20x Saline Natriumcitrat (SSC) genom att använda 3,0 M natriumklorid och 0,30 M trinatriumcitrat framställd på ett avjoniserat vatten buffert med pH 7,0 vid 25 ° C. Späd denna buffe…

Representative Results

Baserat på vår erfarenhet av att använda detta protokoll, kan vi säkert rekommendera denna metod för visualisering och kvantifiering av ER-mitokondrier interaktioner i fixerade celler. Representativa bilder av in situ närhet ligering analys-visualiseras ER-mitokondrier interaktioner i Huh7 hepatokarcinom cellinje, med hjälp av flera par av antikroppar, visas. Såsom visas i fig 2 genom fluorescerande mikroskopi, representerar varje red dot en interaktion …

Discussion

Collectively, our studies indicate that the in situ proximity ligation assay is truly a relevant strategy to follow and quantify endogenous ER-mitochondria interactions in fixed cells, without the need for using organelle-specific fluorophores or fluorescent proteins. The specific use of VDAC1/IP3R1 antibodies has been adapted to study ER-mitochondria interactions in HuH7 cells. However, alternative isoforms of VDAC and IP3R may be used, depending on the cell type. In this case, antibodies need to be validated b…

Materials

Formaldehyde	Sigma	F-8775
Glycine	Sigma	G-8898
Triton	Sigma	T8532
35mm Glass bottom culture dishes	MatTeK corporation	P35G-0-14-C
Blocking solution	Sigma	DUO-92004 or DUO-92002	provided in the Duolink PLA probes, Sigma
VDAC1 antibody	Abcam	ab14734
IP3R1-H80 antibody	Santa Cruz	sc28614
CypD antibody	Abcam	ab110324
Grp75 antibody	Santa Cruz	sc13967
TBS 10X	euromedex	ET220	Dilute to obtain 1X
Tween 100X	euromedex	2001-B	dilute in TBS to obtain 0,01%
PLA Probes Mouse MINUS	Sigma	DUO-92004	Duolink, Sigma
PLA Probes Rabbit PLUS	Sigma	DUO-92002	Duolink, Sigma
Duolink detection reagents red	Sigma	DUO-92008	Duolink, Sigma
Ligation solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Ligase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Amplification solution	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Polymerase	Sigma	DUO-92008	Part of the Duolink detection reagents red, Sigma
Duolink Mounting Medium	Sigma	DUO80102	Duolink, Sigma
Softwares:
Blob-finder software			BlobFinder is a freely distributed software that can perform calculations on cells from fluorescence microscopy images. This software can be downloaded for free from The Centre for Image Analysis at Uppsala University who have developed the software and the work was supported by the EU FP6 Project ENLIGHT and  Olink Bioscience. http://www.cb.uu.se/~amin/BlobFinder/index_files/Page430.htm
ImageJ software			Can be downloaded for free from: http://rsb.info.nih.gov/ij/download.html