En protokol til brug af Förster Resonance Energy Transfer (FRET) -Force Biosensorer at måle mekaniske kræfter på tværs af Nuclear LINC Complex
Summary
A number of FRET-based force biosensors have recently been developed, enabling the protein-specific resolution of intracellular force. In this protocol, we demonstrate how one of these sensors, designed for the linker of the nucleoskeleton-cytoskeleton (LINC) complex protein Nesprin-2G can be used to measure actomyosin forces on the nuclear LINC complex.
Abstract
The LINC complex has been hypothesized to be the critical structure that mediates the transfer of mechanical forces from the cytoskeleton to the nucleus. Nesprin-2G is a key component of the LINC complex that connects the actin cytoskeleton to membrane proteins (SUN domain proteins) in the perinuclear space. These membrane proteins connect to lamins inside the nucleus. Recently, a Förster Resonance Energy Transfer (FRET)-force probe was cloned into mini-Nesprin-2G (Nesprin-TS (tension sensor)) and used to measure tension across Nesprin-2G in live NIH3T3 fibroblasts. This paper describes the process of using Nesprin-TS to measure LINC complex forces in NIH3T3 fibroblasts. To extract FRET information from Nesprin-TS, an outline of how to spectrally unmix raw spectral images into acceptor and donor fluorescent channels is also presented. Using open-source software (ImageJ), images are pre-processed and transformed into ratiometric images. Finally, FRET data of Nesprin-TS is presented, along with strategies for how to compare data across different experimental groups.
Introduction
Kraft-følsom, har genetisk indkodede FRET sensorer nylig opstået som et vigtigt værktøj til måling trækkræfter-baserede kræfter i levende celler, hvilket giver indsigt i, hvordan mekaniske kræfter påføres tværs proteiner 1, 2, 3, 4. Med disse værktøjer, forskere kan ikke-invasivt billede intracellulære kræfter i levende celler ved hjælp af konventionelle fluorescerende mikroskoper. Disse sensorer består af et FRET-par (donor og acceptor fluorescerende proteiner, hyppigst en blå donor og gul acceptor) adskilt af et elastisk peptid 3. I modsætning til C- eller N-terminale tagging, denne sensor indsættes i et internt sted i et protein for at måle den mekaniske kraft, der overføres på tværs af proteinet, opfører sig som en molekylær strain-gauge. Øget mekanisk spænding tværs resultaterne sensor i en forøget afstand mellem FRET-pluft, hvilket resulterer i nedsat FRET 3. Som et resultat heraf FRET omvendt relateret til trækkraft.
Disse fluorescerende-baserede sensorer er blevet udviklet til fokale adhæsionsproteiner (vinculin 3 og talin 4), cytoskeletale proteiner (α-actinin 5), og celle-celle-junction-proteiner (E-Cadherin 6, 7, VE-cadherin 8, og PECAM 8). Den hyppigst anvendte og velkarakteriserede elastisk linker i disse biosensorer er kendt som TSmod og består af en repetitiv sekvens af 40 aminosyrer, (GPGGA) 8, som blev afledt fra edderkoppesilkeproteinet piskeformede. TSmod har vist sig at opføre sig som et lineært elastisk nano-fjeder, med FRET respons på 1 til 5 pN af trækkraft 3. Forskellige længder af piskeformede kan anvendes til at ændre den dynamiske range af TSmod FRET-force følsomhed 9. Foruden piskeformede, spektrin gentager 5 og villin headpiece peptid (kendt som HP35) 4 er blevet anvendt som de elastiske peptider mellem FRET-par i lignende kraft biosensorer 4. Endelig viste en nylig rapport, at TSmod også kan anvendes til at detektere trykkræfter 10.
Vi har for nylig udviklet en kraftsensor til linker med nucleo-cytoskelettet (LINC) kompleks protein Nesprin2G ved hjælp TSmod indsat i en tidligere udviklet trunkeret Nesprin2G protein kendt som mini-Nesprin2G (figur 2C), som opfører sig på lignende måde som endogent Nesprin-2G 11. Den LINC Komplekset indeholder multiple proteiner, der fører fra ydersiden til indersiden af kernen, der forbinder den cytoplasmiske cytoskelet til den nukleare lag. Nesprin-2G er et strukturelt protein binding til bådeaktincytoskelettet i cytoplasmaet og SUN proteiner i perinukleære rum. Ved hjælp af vores biosensor, kunne vi vise, at Nesprin-2G er underlagt actomyosin-afhængig spænding i NIH3T3 fibroblaster 2. Dette var første gang, at styrke blev målt direkte på tværs et protein i den nukleare LINC kompleks, og det er sandsynligt, at blive et vigtigt redskab til at forstå betydningen af kraft på kernen i mechanobiology.
Protokollen nedenfor giver en detaljeret metode til, hvordan man bruger Nesprin-2G kraftsensor, herunder ekspressionen af Nesprin spændingsføler (Nesprin-TS) i pattedyrsceller, samt erhvervelse og analyse af FRET billeder af celler, der udtrykker Nesprin- TS. Anvendelse af et omvendt konfokalt mikroskop udstyret med en spektral detektor, FRET en beskrivelse af hvordan man måler sensibiliserede emission under anvendelse af spektral unmixing og ratiometrisk FRET billeddannelse er tilvejebragt. Udgangen ratiometriske billeder kan bruges til at lave relativ quantitative kraft sammenligninger. Mens denne protokol er fokuseret på ekspressionen af Nesprin-TS i fibroblaster, er det let at tilpasse til andre mammale celler, herunder begge cellelinier og primære celler. Endvidere kan denne protokol som den vedrører billederhvervelse og FRET-analyse let tilpasses til andre FRET-baserede kraft biosensorer, der er blevet udviklet til andre proteiner.
Protocol
Representative Results
Discussion
En fremgangsmåde og demonstration af levende celler af mekanisk spænding tværs Nesprin-2G, et protein i den nukleare LINC komplekset, blev skitseret ovenfor. Forud for dette arbejde, forskellige teknikker, såsom mikropipetteaspirationsteknik, magnetisk-perle cytometri, og mikroskopisk laser-ablation, er blevet anvendt til at anvende pres på cellekernen og måle dens bulk-materialeegenskaber 16, 17, 18. Men ind…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbejde blev støttet af Thomas F. og Kate Miller Jeffress Memoria Trust (til DEC) og NIH give R35GM119617 (til DEC). Det konfokale mikroskop billeddannelse blev udført ved VCU nanomaterialer Karakterisering Core (NCC) Facility.
Materials
| Nesprin-TS DNA | Addgene | 68127 | Retrieve from https://www.addgene.org/68127/ |
| Nesprin-HL DNA | Addgene | 68128 | Retrieve from https://www.addgene.org/68128/ |
| mTFP1 DNA | Addgene | 54613 | Retrieve from https://www.addgene.org/54613/ |
| mVenus DNA | Addgene | 27793 | Retrieve from https://www.addgene.org/27793/ |
| TSmod DNA | Addgene | 26021 | Retrieve from https://www.addgene.org/26021/ |
| Competent Cells | Bioline | BIO-85026 | |
| Liquid LB Media | ThermoFisher | 10855001 | https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/10855001 |
| Solid LB Bacterial Culture Plates | Sigma-Aldrich | L5667 | http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/l5667?lang=en®ion=US |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| Spectrophotometer | Biorad | 273 BR 07335 | SmartSpec Plus |
| quartz cuvette | Biorad | 1702504 | Cuvette for SmartSpec Plus |
| DNA isolation kit | Macherey-Nagel | 740412.5 | NucleoBond Xtra Midi Plus |
| 6-well cell culture dish | Falcon-Corning | 353046 | Multiwell 6-well Polystrene Culture Dish |
| Dulbecco's Modified Eagle Medium, (DMEM) cell media | Gibco | 11995-065 | DMEM(1x) |
| Bovine Serum | Life Technologies | 16170-078 | |
| reduced serum cell media | Gibco | 31985-070 | Reduced Serum Medium, "optimem" |
| Lipid Carrier Solution | invitrogen | 11668-019 | Lipid Reagent, "Lipofectamine 2000" |
| 1.5mL sterile plastic tube | Denville | c2170 | |
| Trypsin | Gibco | 25200-056 | 0.25% Trypsin-EDTA (1x) |
| glass-bottom microscope viewing dish | In Vitro Scientific | D35-20-1.5-N | 35mm Dish with 20mm Bottom Well #1.5 glass |
| Fibronectin | ThermoFisher | 33016015 | fibronectin human protein,plasma |
| Phosphate Buffered Saline (PBS) | Gibco | 14190-144 | Dulbecco's Phosphate Buffered Saline |
| 15mL sterile centrifuge tube | Greiner bio-one | 188261 | |
| swinging rotor centrifuge | Thermo electron | Centra CL2 | Swinging rotor thermo electron 236 |
| cell culture biosafety hood | Forma Scientific | 1284 | |
| climate controlled cell culture incubator | ThermoFisher | 3596 | |
| inverted LED widefield fluorescent microscope | Life technologies | EVOS FL | |
| Clear HEPES buffered imaging media | Molecular Probes | A14291DJ | |
| Fetal bovine Serum | Life technologies | 10437-028 | |
| Temperature Controlled-Inverted confocal w/458 and 515nm laser sources | Zeiss | LSM 710-w/spectral META detector | |
| Outgrowth Media | Newengland Biolabs | B9020s | |
| NIH 3T3 Fibroblasts | ATCC | CRL-1658 |
References
- Conway, D. E., Schwartz, M. A. Flow-dependent cellular mechanotransduction in atherosclerosis. J Cell Sci. 126, 5101-5109 (2013).
- Arsenovic, P. T., Ramachandran, I., et al. Nesprin-2G, a Component of the Nuclear LINC Complex, Is Subject to Myosin-Dependent Tension. Biophys J. 110 (1), 34-43 (2016).
- Grashoff, C., Hoffman, B. D., et al. Measuring mechanical tension across vinculin reveals regulation of focal adhesion dynamics. Nature. 466 (7303), 263-266 (2010).
- Austen, K., Ringer, P., et al. Extracellular rigidity sensing by talin isoform-specific mechanical linkages. Nat Cell Bio. 17 (12), 1597-1606 (2015).
- Meng, F., Sachs, F. Visualizing dynamic cytoplasmic forces with a compliance-matched FRET sensor. J Cell Sci. 124, 261-269 (2011).
- Borghi, N., Sorokina, M., et al. E-cadherin is under constitutive actomyosin-generated tension that is increased at cell-cell contacts upon externally applied stretch. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 109 (31), 12568-12573 (2012).
- Cai, D., Chen, S. -. C., et al. Mechanical Feedback through E-Cadherin Promotes Direction Sensing during Collective Cell Migration. Cell. 157 (5), 1146-1159 (2014).
- Conway, D. E., Breckenridge, M. T., Hinde, E., Gratton, E., Chen, C. S., Schwartz, M. A. Fluid Shear Stress on Endothelial Cells Modulates Mechanical Tension across VE-Cadherin and PECAM-1. Curr Bio CB. 23 (11), 1024-1030 (2013).
- Brenner, M. D., Zhou, R., et al. Spider Silk Peptide Is a Compact, Linear Nanospring Ideal for Intracellular Tension Sensing. Nano Lett. 16 (3), 2096-2102 (2016).
- Rothenberg, K. E., Neibart, S. S., LaCroix, A. S., Hoffman, B. D. Controlling Cell Geometry Affects the Spatial Distribution of Load Across Vinculin. Cell Mol Bioeng. 8 (3), 364-382 (2015).
- Ostlund, C., Folker, E. S., Choi, J. C., Gomes, E. R., Gundersen, G. G., Worman, H. J. Dynamics and molecular interactions of linker of nucleoskeleton and cytoskeleton (LINC) complex proteins. J Cell Sci. 122, 4099-4108 (2009).
- Froger, A., Hall, J. E. Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method. J Vis Exp. (6), e253 (2007).
- Zhang, S., Cahalan, M. D. Purifying plasmid DNA from bacterial colonies using the QIAGEN Miniprep Kit. J Vis Exp. (6), e247 (2007).
- Rodighiero, S., Bazzini, C., et al. Fixation, mounting and sealing with nail polish of cell specimens lead to incorrect FRET measurements using acceptor photobleaching. Cell. Physiol. Biochem. 21 (5-6), 489-498 (2008).
- Kardash, E., Bandemer, J., Raz, E. Imaging protein activity in live embryos using fluorescence resonance energy transfer biosensors. Nat Protoc. 6 (12), 1835-1846 (2011).
- Vaziri, A., Mofrad, M. R. K. Mechanics and deformation of the nucleus in micropipette aspiration experiment. J Biomech. 40 (9), 2053-2062 (2007).
- Wang, N., Naruse, K., et al. Mechanical behavior in living cells consistent with the tensegrity model. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 98 (14), 7765-7770 (2001).
- Nagayama, K., Yahiro, Y., Matsumoto, T. Stress fibers stabilize the position of intranuclear DNA through mechanical connection with the nucleus in vascular smooth muscle cells. FEBS letters. 585 (24), 3992-3997 (2011).
- Luxton, G. W. G., Gomes, E. R., Folker, E. S., Vintinner, E., Gundersen, G. G. Linear arrays of nuclear envelope proteins harness retrograde actin flow for nuclear movement. Science. 329 (5994), 956-959 (2010).
- Chen, Y., Mauldin, J. P., Day, R. N., Periasamy, A. Characterization of spectral FRET imaging microscopy for monitoring nuclear protein interactions. J Microsc. 228, 139-152 (2007).
- Ran, F. A., Hsu, P. D., Wright, J., Agarwala, V., Scott, D. A., Zhang, F. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nat Protoc. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- LaCroix, A. S., Rothenberg, K. E., Berginski, M. E., Urs, A. N., Hoffman, B. D. Construction, imaging, and analysis of FRET-based tension sensors in living cells. Methods Cell Biol. , (2015).
