अधिनियम-हाथ की सफ़ाई (सक्रिय स्पष्टता तकनीक दबाव संबंधित कुशल और स्थिर अंगों में अणुओं का हस्तांतरण) निष्क्रिय प्रसार या दबाव की मदद से प्रसव के द्वारा मंजूरी दे दी ऊतकों में तेजी से, कुशल, लेकिन सस्ती ऊतक समाशोधन और तेजी से एंटीबॉडी प्रवेश सक्षम बनाता है। इस विधि का प्रयोग, ऊतकों की एक विस्तृत श्रृंखला को मंजूरी दे दी जा सकती है कई एंटीबॉडी द्वारा immunolabeled, और मात्रा-imaged।
पहचान और अंगों की या सेलुलर स्तर पर पूरे शरीर की विस्तृत संगठन के अन्वेषण के जीव विज्ञान के क्षेत्र में मौलिक चुनौतियां हैं। संक्रमणकालीन तरीकों समय और एक 3 डी छवि प्राप्त करने के लिए प्रयास की एक पर्याप्त राशि और बरकरार ऊतक सेक्शनिंग immunolabeling सहित, और इमेजिंग क्रमानुसार-sectioned ऊतक, जो इस प्रक्रिया के हर कदम पर जानकारी का नुकसान पैदा करता है की आवश्यकता होती है। बरकरार ऊतक के भीतर उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए हाल ही में विकसित दृष्टिकोण में, आणविक लक्षण वर्णन प्रोटीन की लेबलिंग के लिए प्रतिबंधित कर दिया गया है। हालांकि, अंग समाशोधन के लिए वर्तमान में उपलब्ध प्रोटोकॉल एक काफी लंबी प्रक्रिया के समय की आवश्यकता है, यह मुश्किल प्रयोगशाला में ऊतक समाशोधन तकनीकों को लागू करने के लिए कर रही है। हमने हाल ही में स्थापित एक तेजी से और अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य करार दिया प्रोटोकॉल अधिनियम-हाथ की सफ़ाई (एक ctive ग larity टी echnique- पी ressure आर ई fficient और एस तालिका टी ransfer उत्तेजितओ rgans) है, जो कई घंटे के भीतर ऊतक मंजूरी के लिए अनुमति देता में अणुओं की। इसके अलावा, अधिनियम-सफ़ाई पारंपरिक तरीकों के साथ तेजी से immunolabeling सक्षम बनाता है और घनी का गठन, मोटी नमूनों की गहरी परत में दबाव या संवहन प्रवाह को लागू करने से एंटीबॉडी प्रवेश accelerates। हम कैसे ऊतकों, वैद्युतकणसंचलन का उपयोग लिपिड हटाने से साफ करने के लिए कैसे तैयार करने के लिए का वर्णन है, और एक दबाव की मदद से प्रसव के द्वारा कैसे इम्युनो-दाग। तेज़ी और प्रोटोकॉल की निरंतरता 3 डी ऊतकीय अनुसंधान और मात्रा के आधार पर निदान के प्रदर्शन में तेजी लाने जाएगा।
तंत्रिका विज्ञान में चुनौतियों में से एक neuronal सर्किट तारों और बरकरार मस्तिष्क ऊतक के भीतर व्यक्ति की कोशिकाओं के दृश्य है। अभी हाल तक, इस तरह से न्यूरॉन्स के बीच कनेक्शन का प्रदर्शन अपेक्षित 1) ऊतकों के धारावाहिक सेक्शनिंग; 2) इस तरह एक्सोन या प्रोटीन के रूप में विशिष्ट लक्ष्यों की आणविक लेबलिंग; और 3) कम्प्यूटेशनल पंजीकरण या 2 डी छवियों सीरियल 1 के संरेखण के माध्यम से पूरे दिमाग के 3D पुनर्निर्माण द्वारा दृश्य। ये कदम, श्रमसाध्य हैं समय का एक बड़ा सौदा की आवश्यकता है, और सेक्शनिंग और लेबलिंग, न्यूरोनल नेटवर्क मानचित्रण बेहद मुश्किल बना दौरान जानकारी खोने के लिए उत्तरदायी हैं। हालांकि, कई तरीकों कि सेक्शनिंग बिना बरकरार ऊतक के दृश्य के लिए अनुमति देने के लिए विकसित किया गया है। जैविक ऊतकों ऊतक समाशोधन तकनीक 2-10 द्वारा ऑप्टिकली पारदर्शी बनाया जा सकता है। प्रमुख तरीकों में से एक बरकरार ऊतक और व्यवस्था में विसर्जन के समाधान के बीच अपवर्तनांक मतभेदों को कम करने के लिए हैबरकरार ऊतक में प्रकाश बिखरने को कम करने के लिए, इस प्रकार के ऊतकों पारदर्शी प्रतिपादन और गहरी संरचनाओं का अवलोकन सक्षम करने से। विसर्जन के समाधान के कुछ प्रकार के हाइड्रोफोबिक गुण है, जो निर्जलीकरण की प्रक्रिया के दौरान तेजी से फ्लोरोसेंट शमन में परिणाम है। इसलिए, उन तरीकों समय 11,12 की एक लंबी अवधि में फ्लोरोसेंट इमेजिंग के साथ संगत नहीं हैं। हाइड्रोफोबिक अभिकर्मकों के बजाय, अन्य तरीकों जैसे SeeDB 4 और SCA एल ई 6 ऊतक समाशोधन के लिए हाइड्रोफिलिक अभिकर्मकों, जो जैविक ऊतक 4,6,8 के संरचनात्मक जानकारी और प्रतिदीप्ति बनाए रखने का उपयोग करें। हालांकि, बड़े अणुओं, एंटीबॉडी सहित बरकरार ऊतक के कोर प्रसार से अकेले नहीं पहुँच सकते हैं। इसलिए, घनी पैक ऊतकों की गहरी क्षेत्रों में लक्ष्य अणुओं की पूर्व लेबलिंग तकनीकी रूप से चुनौतीपूर्ण है।
एक हाल ही में विकसित ऊतक समाशोधन विधि में, स्पष्टता 3, एक हाइड्रोजेल एम्बेडेड जैविक ऊतक मैंएक्रिलामाइड के साथ बनाई है, और लिपिड सोडियम dodecyl सल्फेट (एसडीएस) युक्त समाधान के तहत वैद्युतकणसंचलन से हटा रहे हैं। नमूना तो एक मेल चिंतनशील सूचकांक के साथ एक समाधान में डूब जाता है प्रकाश बिखरने 3 कम करने के लिए। लिपिड हटाने की व्यवस्था बाद में उन्नत स्पष्टता 13 और संधि (निष्क्रिय स्पष्टता तकनीक) 10 में संशोधित किया गया था। polymerization के बाद, एक्रिलामाइड चेन प्रोटीन के साथ crosslink, बनाने हाइड्रोजेल-ऊतक। लिपिड घटकों एक्रिलामाइड साथ crosslink नहीं कर सकते हैं; इस प्रकार, लिपिड एसडीएस युक्त बफर के तहत वैद्युतकणसंचलन से समाप्त किया जा सकता है। लिपिड के सक्रिय उन्मूलन के माध्यम से, मस्तिष्क के ऊतकों स्पष्ट रूप से पारदर्शिता 9 में बढ़ जाती है। हालांकि, इन तरीकों मुक्त प्रसार से गहरे लेबलिंग के असंभव पता नहीं है। इस सीमा को पार करने के लिए, मोटी ऊतकों के गहरे भागों में अभिकर्मकों के सक्रिय परिवहन के लिए तकनीक की आवश्यकता है।
स्पष्टता ऊतक समाशोधन और गहरी ऊतक की अनुमति देता हैदृश्य, यह एक आसान या तेजी से प्रक्रिया नहीं है। यह कई सप्ताह लेने के लिए एक पूरे माउस मस्तिष्क 7,14 स्पष्ट कर सकते हैं। ऊतकों की रैपिड समाशोधन जीवन विज्ञान अनुसंधान या मात्रा निदान के लिए बुनियादी या नैदानिक प्रयोगशाला सेटिंग्स करने के लिए इस तरह के तरीकों के आवेदन के लिए आवश्यक है। वर्तमान प्रोटोकॉल दबाव की मदद से प्रसव इम्युनो-धुंधला द्वारा जैविक ऊतक निकासी और बाद में प्रोटीन का पता लगाने के लिए एक सरल प्रक्रिया है। यह इमेजिंग तरीकों के साथ संयोजन के माध्यम से बड़ी दायर की और 3 डी डेटा प्रोसेसिंग सिस्टम के उच्च संकल्प मात्रा इमेजिंग के लिए उपयुक्त है।
गरीब निर्धारण या ऊतकों में हाइड्रोजेल विसर्जन प्रोटीन की हानि और ऊतक समाशोधन प्रक्रिया के दौरान ऊतक की विकृति पैदा कर सकता है। पूरे वयस्क माउस मस्तिष्क रात भर 4% paraformaldehyde में incubated किया जाना चाहिए, 12 के लिए हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान के 20 एमएल की एक न्यूनतम मात्रा में विसर्जन के द्वारा पीछा किया – कोमल झटकों के साथ 18 घंटे। इस तरह के मस्तिष्क के स्लाइस और रीढ़ की हड्डी के रूप में बड़े ऊतकों, मानव ऊतक सहित, हाइड्रोजेल मोनोमर समाधान में समय भिगोने की आवश्यकता है बढ़ाया। अधिनियम प्रोटोकॉल तय ऊतकों के समाशोधन के लिए आसानी से लागू है क्योंकि ऊतक निर्धारण और बहुलक अर्क कदम अलग हो रहे हैं। ऊतक साफ़ करने के बाद, मानव ऊतकों कई एंटीबॉडी के साथ अच्छी तरह से दाग रहे थे। ध्यान दें कि अधिनियम समाशोधन तकनीक जैसे इथेनॉल और मेथनॉल के रूप में शराब fixatives, के साथ संगत नहीं है।
ऊतक हाइड्रोजेल polymerization कदम भी समाशोधन प्रक्रिया के बाद अच्छी गुणवत्ता वाले ऊतक का निर्माण करने के लिए महत्वपूर्ण है। इसलियेऑक्सीजन एक्रिलामाइड के polymerization रोकता है, यह एक नाइट्रोजन गैस संचार व्यवस्था के तहत ऊतक युक्त समाधान degassing से हटाया जाना चाहिए। वैकल्पिक रूप से, डे-oxygenation 23 घंटे के लिए एक गर्मी ब्लॉक के साथ एक निर्वात चैम्बर का उपयोग कर मार डाला जा सकता है।
समाशोधन दर अंग आकार, लिपिड या ईसीएम रेशेदार प्रोटीन की सामग्री, निर्धारण की स्थिति, आदि अधिकांश वयस्क माउस ऊतकों रात भर आदि द्वारा मंजूरी दी जा सकती सहित कई कारकों पर निर्भर है। हालांकि, वहाँ के एक जोखिम है पर समाशोधन और ऊतकों में सूजन अनावश्यक; इस प्रकार, समाशोधन समय में मतभेद महत्वपूर्ण विचार कर रहे हैं। ऊतक समाशोधन की स्थिति अनुभव से निर्धारित किया जाना चाहिए। महत्वपूर्ण बात है, ईसीएम की सामग्री को मंजूरी दे दी ऊतक की उपस्थिति को प्रभावित कर सकता है। ऊतकों के रंग क्योंकि अधिनियम घने प्रोटीन फाइबर स्पष्ट नहीं है सफेद या अपारदर्शी बनी हुई है, आदि बफर में अधिनियम के बाद भी। हालांकि, जब इन अंगों आरआई मिलान समाधान में डूब रहे थे,Y पारदर्शी बन गया।
ऊतक सूजन के ऊतकों की दर ईसीएम सामग्री, और इस तरह के मस्तिष्क के रूप में मुलायम अंगों पर निर्भर होने के लिए, घने अंगों की तुलना में एक अधिक से अधिक सूजन अनुपात का प्रदर्शन होता है। क्योंकि वृद्धि ऊतक ऊतक समाशोधन प्रक्रिया में मदद मिलेगी सूजन, अधिनियम नियमित तौर पर ज्यादातर मामलों में पानी आधारित बफर आसुत इस्तेमाल करता है। कुछ मामलों में, जब ऊतक सूजन या क्षणिक विकृति ऐसे भ्रूण के रूप में वांछनीय नहीं है, बफर युक्त 0.1x पीबीएस उच्च संकल्प इमेजिंग के लिए आवेदन किया जा सकता है। यह भी ध्यान दिया जाना चाहिए बफर में उच्च नमक सांद्रता ऊतकों की सिकुड़न का कारण बन सकता है।
अधिनियम विधि पूरे अंगों और एक माउस 14 के भी पूरे शरीर को स्पष्ट कर सकते हैं। हालांकि, पारदर्शी ऊतकों की गहरी ऊतक इमेजिंग विशेष माइक्रोस्कोप और उद्देश्यों की आवश्यकता है। इस प्रकार, मस्तिष्क के ऊतकों 1- करने के लिए 2 मिमी मोटी एक पारंपरिक confocal खुर्दबीन के साथ इमेजिंग के लिए सबसे प्रभावी है। हमारे हाथ में, लेबल को हटाने केअधिनियम संसाधित ऊतकों से एड एंटीबॉडी एंटीबॉडी निर्भर है, और विभिन्न एंटीबॉडी लेबलिंग के दौर की सिफारिश नहीं कर रहे हैं। ऐसी वें और GFAP के रूप में कई एंटीबॉडी, पूरे मस्तिष्क immunolabeling 14 के लिए विशेष रूप से अच्छी तरह से काम किया। दूसरी ओर, इस तरह के Tuj1 या MAP2 के रूप में कुछ एंटीबॉडी, अक्सर ही ऊतकों की सतह लेबल। इस तरह के स्विच 15 के रूप में अन्य तरीकों से सुधार किया जा सकता है। एक अन्य संभावित सीमा है कि यह क्योंकि ऊतक ऊतक समाशोधन चरण के दौरान सूजन और सिकुड़न के अधिनियम संसाधित ऊतक में ठीक प्रोटीन संरचनाओं की रक्षा करने के लिए मुश्किल हो सकता है।
हाथ की सफ़ाई तकनीक ऊतक लेबलिंग तकनीक की एक विस्तृत विविधता के लिए लागू है। उदाहरण के लिए, इस तरह के SeeDB 4 और iDISCO 7 के रूप में पूर्व लेबल ऊतक का उपयोग ऊतक पारदर्शी तरीके, में, घने ऊतक के immunolabeling सप्ताह के लिए कई दिनों से अधिक समय ऊष्मायन अवधि की आवश्यकता है। हालांकि, हाथ की सफ़ाई कई घंटे ऊष्मायन समय कम कर सकते हैं, ई1-मिमी मोटी घने ऊतक के साथ एक दिन के भीतर पूरी प्रक्रिया के पूरा होने के nabling। हाथ की सफ़ाई गहरे लेबलिंग घने ऊतकों, या यहां तक कि संयुक्त राष्ट्र को मंजूरी दे दी मोटी ऊतकों की प्रभावकारिता को बढ़ा सकते हैं। क्योंकि हाथ की सफ़ाई एक टेबल टॉप सेंट्रीफ्यूज या सिरिंज पंप का उपयोग करता है और किसी भी विशेष उपकरण की आवश्यकता नहीं है, यह नियमित प्रयोगशाला प्रक्रियाओं के साथ इस तकनीक को लागू करने के लिए अपेक्षाकृत आसान है।
The authors have nothing to disclose.
This research was supported by the Brain Research Program through the National Research Foundation (NRF) funded by the Korean Ministry of Science, ICT, and Future Planning (NRF-2015M3C7A1028790).
4% Paraformaldehyde | Lugen SCI | LGB-1175-4B | sample fixation |
Acrylamide | Affymetrix | 75820 | Hydrogel monomer solution |
2,2’-Azobis[2-(2-imidazolin-2-yl) propane] dihydrochloride | Wako Pure Chemical Industries | VA-044 | Hydrogel monomer solution |
Boric acid | Affymetrix | 76324 | ETC buffer |
Sodium Dodecyl Sulfate (SDS) | Affymetrix | 18220 | ETC buffer |
Sodium hydroxide pellets | Junsei chemical | 1310-73-2 | ETC buffer |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Santa Cruz Biotechnology | sc-2323A | Immunolabeling |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8787 | Immunolabeling |
Sodium azide | Sigma-Aldrich | S2002 | Immunolabeling |
Collagen type Ⅳ | Abcam | AB6586 | Antibody/immunolabeling |
Tyrosine hydroxylase (TH) | Millipore | AB152 | Antibody/immunolabeling |
Alexa Fluor Cy3 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 711-165-152 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Alexa Fluor 488 Donkey anti-Rabbit IgG (H+L) | Life Technologies – Molecular Probes | A21206 | Secondary antibody/ immunolabeling |
Confocal dish | SPL lifesciences | 101350 | Imaging |
Confocal microscope | Leica | SP8 | Imaging |
Sucrose | Junsei chemical | 31365-0301 | CUBIC-mount solution |
Urea | Affymetrix | 23036 | CUBIC-mount solution |
N,N,N’,N’-tetrakis(2-hydroxypropyl)ethylenediamine | Sigma-Aldrich | 122262 | CUBIC-mount solution |
ECT chamber | Logos Biosystems, Inc. | C10101 | ETC system |
ECT chamber controller | Logos Biosystems, Inc. | C10201 | ETC system |
Temperature probe | Logos Biosystems, Inc. | C12101 | ETC system |
Peristatic pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | YZ1515X | ETC system |
Buffer reservoir | Logos Biosystems, Inc. | C10401 | ETC system |
Tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12001 | ETC system |
Container holder for 1 tissue container | Logos Biosystems, Inc. | C12002 | ETC system |
Mouse brain slice holder | Logos Biosystems, Inc. | C12004 | ETC system |
Whole rat brain holder | Logos Biosystems, Inc. | C12007 | ETC system |
Peristaltic pump tubing | Logos Biosystems, Inc. | C12104 | ETC system |
Tabletop-centrifuge | Hanil science industrial Co., Ltd | MICRO 12 | c-PRESTO |
Syringe pump | Baoding longer precision pump Co., Ltd | LSP02-1B | s-PRESTO |
Syringe (20 ml) | Korea vaccine Co., Ltd. | KV-S20 | s-PRESTO |
3-way stopcock | Hyupsung medical Co.,Ltd. | HS-T-01N | s-PRESTO |