कुशल और साइट विशेष तनाव प्रवर्तित अब्द-alkyne cycloaddition द्वारा एंटीबॉडी लेबलिंग
Summary
Here, we present a protocol to site-specifically introduce chemical probes into an antibody fragment by genetically incorporating an azide-containing amino acid, and subsequently coupling the azide with a chemical probe by strain-promoted azide-alkyne cycloaddition (SPAAC).
Abstract
वर्तमान में कई रासायनिक उपकरण उनकी संरचना और समारोह का अध्ययन करने के लिए प्रोटीन में रासायनिक जांच के परिचय के लिए उपलब्ध हैं। एक उपयोगी तरीका आनुवंशिक रूप से एक bioorthogonal कार्यात्मक समूह युक्त एक अप्राकृतिक अमीनो एसिड को शुरू करने से प्रोटीन विकार है। इस रिपोर्ट में यह साइट विशेष एंटीबॉडी विकार के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन है। प्रोटोकॉल एक azide युक्त एमिनो एसिड की आनुवंशिक समावेश, और तनाव प्रवर्तित azide-alkyne cycloaddition (SPAAC) द्वारा विकार प्रतिक्रिया के लिए प्रयोगात्मक विवरण शामिल हैं। इस तनाव प्रवर्तित प्रतिक्रिया शारीरिक पीएच और तापमान पर प्रतिक्रिया अणुओं की साधारण मिश्रण से गुज़रता है, और इस तरह तांबे (आई) आयनों और तांबे chelating ligands के रूप में अतिरिक्त अभिकर्मकों की आवश्यकता नहीं है। इसलिए, इस विधि सामान्य प्रोटीन विकार और एंटीबॉडी दवा conjugates (एडीसी) के विकास के लिए उपयोगी होगा।
Introduction
चूंकि कोलाई में पी -methoxyphenylalanine के आनुवंशिक समावेश सूचना मिली थी, 1 100 से अधिक अप्राकृतिक अमीनो एसिड (UAAs) सफलतापूर्वक विभिन्न प्रोटीन में शामिल किया गया है। 1-3 इन UAAs के अलावा, अमीनो bioorthogonal कार्य समूहों युक्त एसिड बड़े पैमाने पर अध्ययन और सबसे बड़ा अनुपात का प्रतिनिधित्व कर दिया है। Bioorthogonal कार्यात्मक UAAs में इस्तेमाल समूहों कीटोन, 4 azide, 5 alkyne, 6 cyclooctyne, 7 tetrazine, 8 α, β-असंतृप्त एमाइड, 9 norbonene, 10 transcyclooctene, 11 और bicyclo [6.1.0] -nonyne शामिल हैं। 11 यद्यपि प्रत्येक कार्य समूह ने अपने फायदे और नुकसान है, azide युक्त एमिनो एसिड सबसे बड़े पैमाने पर प्रोटीन विकार के लिए इस्तेमाल किया गया है। पी -Azidophenylalanine (वायुसेना), azido युक्त एमिनो एसिड में से एक, आसानी से उपलब्ध है, और इसके समावेश efficiency उत्कृष्ट है। उत्परिवर्ती इस एमिनो एसिड युक्त प्रोटीन तांबा उत्प्रेरित cycloaddition द्वारा या SPAAC द्वारा cyclooctynes साथ alkynes साथ प्रतिक्रिया व्यक्त की जा सकती है। 12-20
हाल ही में, बायोफार्मास्यूटिकल्स दवा उद्योग में काफी ध्यान आकर्षित किया गया है। एंटीबॉडी दवा साधना (एडीसी) मानव कैंसर के उपचार के लिए 21 और लक्षित चिकित्सा के लिए उनकी क्षमता के कारण चिकित्सीय एंटीबॉडी कि फायदेमंद हैं का एक वर्ग है अन्य रोगों। 50 से अधिक एडीसी नैदानिक परीक्षण में वर्तमान में कर रहे हैं, और संख्या तेजी से बढ़ रही है। एडीसी के विकास में, कई कारकों प्रभावकारिता को अधिकतम और दुष्प्रभावों को कम करने के लिए विचार किया जाना चाहिए। इन कारकों के अलावा, एक कुशल और साइट विशेष विकार प्रतिक्रिया एक एंटीबॉडी के बीच एक सहसंयोजक बांड के रूप में और एक दवा के लिए महत्वपूर्ण है। वांछित दक्षता और विकार प्रतिक्रिया में विशिष्टता एक में एक bioorthogonal कार्यात्मक समूह के साथ संयोजन के द्वारा प्राप्त किया जा सकताअप्राकृतिक एमिनो एसिड है कि विशेष रूप से एक एंटीबॉडी में शामिल किया है। 22-26 यहाँ, हम करने के लिए एक प्रोटोकॉल रिपोर्ट साइट विशेष रूप से शामिल एक एंटीबॉडी टुकड़ा में वायुसेना और एक जैव रासायनिक जांच के साथ उत्परिवर्ती एंटीबॉडी टुकड़ा एकत्रित।
Protocol
Representative Results
Discussion
प्रोटीन में अप्राकृतिक एमिनो एसिड की आनुवंशिक समावेश प्रोटीन संशोधन के लिए इस्तेमाल अन्य तरीकों पर कई फायदे हैं। महत्वपूर्ण लाभ में से 1-3 से एक प्रोटीन की किसी भी तरह के लिए अपने सामान्य प्रयोज्य?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Materials
| 1. plasmid Construction | |||
| plasmid pBAD_HerFab_L177TAG | optionally contain the amber stop codon(TAG) at a desired position. Ko, W. et al. Efficient and Site-Specific Antibody Labeling by Strain-promoted Azide-Alkyne Cycloaddition. BKCS. 36 (9), 2352-2354, doi: 10.1002/bkcs.10423, (2015) | ||
| plasmid pEvol-AFRS | Young, T. S., Ahmad, I., Yin, J. A., and Schultz, P. G. An enhanced system for unnatural amino acid mutagenesis in E. coli. J. Mol. Biol. 395 (2), 361-374, doi: 10.1016/j.jmb.2009.10.030, (2010) | ||
| DH10B | Invitrogen | C6400-03 | Expression Host |
| Plasmid Mini-prep kit | Nucleogen | 5112 | 200/pack |
| Agarose | Intron biotechnology | 32034 | 500g |
| Ethidium bromide | Alfa Aesar | L07482 | 1g |
| LB Broth | BD Difco | 244620 | 500g |
| 2. Culture preparation | |||
| 2.1) Electroporation | |||
| Micro pulser | BIO-RAD | 165-2100 | |
| Micro pulser cuvette | BIO-RAD | 165-2089 | 0.1cm electrode gap, pkg. of 50 |
| Ampicillin Sodium | Wako | 018-10372 | 25g |
| Chloramphenicol | Alfa Aesar | B20841 | 25g |
| Agar | SAMCHUN | 214230 | 500g |
| SOC medium | Sigma | S1797 | 100ML |
| 3. Expression and purification of HerFab-L177AF | |||
| 3.1 Expression of Herfab-L177AF | |||
| p-azido-L-phenylalanine (AF) | Bachem | F-3075.0001 | 1g |
| L(+)-Arabinose, 99% | Acros | 104981000 | 100g |
| Hydrochloric acid, 35~37% | SAMCHUN | H0256 | 500ml |
| 3.2 Cell lysis | |||
| Tris(hydroxymethyl)aminomethane, 99% | SAMCHUN | T1351 | 500g |
| EDTA disodium salt dihydrate, 99.5% | SAMCHUN | E0064 | 1kg |
| Sucrose | Sigma | S9378 | 500g |
| Lysozyme | Siyaku | 126-0671 | 1g |
| 3.3 Ni-NTA Affinity Chromatography | |||
| Ni-NTA resin | QIAGEN | 30210 | 25ml |
| Polypropylene column | QIAGEN | 34924 | 50/pack, 1ml capacity |
| Imidazole, 99% | SAMCHUN | I0578 | 1kg |
| Sodium phosphate monobasic, 98% | SAMCHUN | S0919 | 1kg |
| Sodium Chloride, 99% | SAMCHUN | S2907 | 1kg |
| 4. Conjugation of Purified HerFab-L177AF with Alkyne Probes Using Strain-Promoted Azide-Alkyne Cycloaddition (SPAAC) | |||
| Cy5.5-ADIBO | FutureChem | FC-6119 | 1mg |
| 5. Purification of Labeled HerFab | |||
| Amicon Ultra 0.5 mL Centrifugal Filters | MILLIPORE | UFC500396 | 96/pack, 500ul capacity |
| 6. SDS-PAGE Analysis of Labeled HerFab and Fluorescent Gel Scanning | |||
| 1,4-Dithio-DL-threitol, DTT, 99.5 % | Sigma | 10708984001 | 10g |
| NuPAGE LDS Sample Buffer, 4X | Thermofisher | NP0007 | 10ml |
| MES running buffer | Thermofisher | NP0002 | 500ml |
| Nupage Novex 4-12% SDS PAGE gels | Thermofisher | NO0321 | 12well |
| Coomassie Brilliant Blue R-250 | Wako | 031-17922 | 25g |
| Typhoon 9210 variable mode imager | Amersham Biosciences |
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