Denne rapporten beskriver en bioengineeringsmetode for å designe og konstruere nye kunstige spleisningsfaktorer (ASFs) som spesifikt modulerer spleising av målgener i pattedyrceller. Denne metoden kan utvides ytterligere til å konstruere ulike kunstige faktorer for å manipulere andre aspekter av RNA-metabolisme.
Behandlingen av de fleste eukaryote RNAer medieres av RNA-bindingsproteiner (RBPs) med modulære konfigurasjoner, inkludert en RNA-gjenkjenningsmodul, som spesifikt binder pre-mRNA-målet og et effektor-domene. Tidligere har vi benyttet den unike RNA-bindingsmodusen til PUF-domenet i humant Pumilio 1 for å generere et programmerbart RNA-bindingsstall, som ble brukt til å konstruere forskjellige kunstige RBP for å manipulere RNA-metabolisme. Her beskrives en detaljert protokoll for å konstruere Engineered Splicing Factors (ESFs) som er spesielt designet for å modulere den alternative spleising av målgener. Protokollen inkluderer hvordan man skal designe og konstruere et tilpasset PUF-stillas for et bestemt RNA-mål, hvordan man konstruerer et ESF-ekspresjonsplasmid ved å kombinere et designer-PUF-domene og et effektor-domene, og hvordan man bruker ESF til å manipulere spleising av målgener. I de representative resultatene av denne metoden har vi også beskrevet de felles analyseneAv ESF-aktiviteter ved hjelp av splitsingsreportere, anvendelsen av ESF i dyrkede humane celler, og den påfølgende effekten av spleising endringer. Ved å følge de detaljerte protokollene i denne rapporten, er det mulig å designe og generere ESFer for regulering av ulike typer Alternative Splicing (AS), og gi en ny strategi for å studere spleisregulering og funksjonen til forskjellige spleisisoformer. Videre kan forskere ved å kombinere forskjellige funksjonelle domener med et designet PUF-domene konstruere kunstige faktorer som målretter mot bestemte RNAer for å manipulere ulike trinn i RNA-behandling.
De fleste humane gener undergå alternativ spleising (AS) for å produsere flere isoformer med forskjellige aktiviteter, som i stor grad har økt kompleksiteten koding av genomet 1, 2. AS gir er en hovedmekanisme for å regulere gen-funksjon, og det er strengt regulert ved forskjellige baner i forskjellige cellulære og utviklingsstadier 3, 4. Fordi spleising misregulation er en vanlig årsak til human sykdom 5, 6, 7, 8, rettet spleising regulering blir et attraktivt terapeutisk rute.
I henhold til en forenklet modell av spleising regulering, AS er i hovedsak kontrollert av spleising Regulatory cis -Elements (SRE) i pre-mRNA som fungerer som spleise forsterkere eller dempere av alternative eksoner. thEse SREs rekrutterer spesifikt ulike transaktive proteinfaktorer ( dvs. spleisefaktorer) som fremmer eller undertrykker spleisereaksjonen 3 , 9 . De fleste transaktive spleisefaktorer har separate sekvensspesifikke RNA-bindende domener for å gjenkjenne deres mål og effektor-domener for å kontrollere spleising. De mest kjente eksemplene er medlemmene av den serine / argininrike (SR) proteinfamilien som inneholder N-terminale RNA-anerkjennelsesmotiver (RRMs), som binder exoniske spleiseforsterkere og C-terminale RS-domener, som fremmer exon-inklusjon 10 . Omvendt binder hnRNP A1 til exonic splice-silencers gjennom RRM-domenene og hemmer ekson-inkludering gjennom et C-terminalt glycinrikt domene 11 . Ved hjelp av slike modulære konfigurasjoner bør forskere kunne konstruere kunstige spleisningsfaktorer ved å kombinere et bestemt RNA-Binding Domain (RBD) med forskjellig effekttor domener som aktiverer eller hemmer spleising.
Nøkkelen av en slik konstruksjon er å bruke en RBD som gjenkjenner gitt mål med programmerbar RNA-bindende spesifisitet, som er analog med den DNA-bindende modusen for den TALE-domenet. Men de fleste naturlige spleise faktorer inneholder RRM eller K Homologi (KH) domener, som gjenkjenner korte RNA-elementer med svak affinitet og således mangler en prediktiv RNA-proteingjenkjennings "kode" 12. Den RBD av PUF vendende proteiner (dvs. PUF domene) har et unikt gjenkjennings RNA-modus, noe som tillater den nye utformingen av PUF domener til spesifikt å gjenkjenne forskjellige RNA er rettet mot 13, 14. Kanonisk PUF domene inneholder åtte gjentagelser av tre a-helikser, som hver gjenkjenner en enkelt base i et 8-nt RNA target. Sidekjedene til aminosyrene i visse posisjoner av de nest α-heliks skjema spesifikke hydrogenbindinger med Watson-Crick kant av tHan RNA base, som bestemmer den RNA bindende spesifisitet av hver repetisjon ( figur 1A ). Koden for RNA-base-anerkjennelse av PUF-gjenta er overraskende enkel ( figur 1A ), slik at generering av PUF-domener som gjenkjenner en mulig 8-basekombinasjon (gjennomgått av Wei og Wang 15 ).
Dette modulære designprinsippet tillater generering av en Engineered Splicing Factor (ESF) som består av et tilpasset PUF-domene og et splicing-modulasjonsdomene ( dvs. et SR-domene eller et Gly-rikt domene). Disse ESFene kan fungere som enten spleiseaktivatorer eller som inhibitorer for å kontrollere ulike typer spleisehendelser, og de har vist seg nyttige som verktøy for å manipulere spleising av endogene gener relatert til menneskers sykdom 16 , 17 . Som et eksempel har vi konstruert PUF-Gly-type ESFer for å spesifikt endre spleising av Bcl-x-genet, Konvertering av anti-apoptotisk lang isoform (Bcl-xL) til pro-apoptotisk kort isoform (Bcl-xS). Forandring av forholdet mellom Bcl-x isoformen var tilstrekkelig til å sensibilisere flere kreftceller til flere anti-kreft kjemoterapi-legemidler 16 , noe som tyder på at disse kunstige faktorene kan være nyttige som potensielle terapeutiske reagenser.
I tillegg til å kontrollere spleising med kjente spleiseffektor-domener ( f.eks. Et RS- eller Gly-rikt domene), kan de konstruerte PUF-faktorene også brukes til å undersøke aktivitetene til nye spleisningsfaktorer. Ved å bruke denne tilnærmingen har vi for eksempel vist at det C-terminale domenet til flere SR-proteiner kan aktivere eller hemme spleising ved binding til forskjellige pre-mRNA-regioner 18 , at det alaninrike motivet av RBM4 kan hemme spleising 19 og at Det prolinrike motivet til DAZAP1 kan forbedre spleising 20 , 21 </ Sup>. Disse nye funksjonelle domener kan brukes til å konstruere andre typer kunstige faktorer for å finjustere spleising.
Denne rapporten gir en detaljert beskrivelse av utformingen og konstruksjonen av kunstige spleise faktorer som spesifikt kan manipulere alternativ spleising av et målgen. Denne fremgangsmåten utnytter fordelene av den unike RNA-bindende modusen for PUF gjentas for å produsere et RNA-bindende stillas med tilpassede spesifisitet. Den kan brukes til enten å aktivere eller undertrykke skjøting.
Det kritiske trinnet i denne protokollen er genereringen av den reprogramed PUF domene som define…
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av NIH stipend R01-CA158283 og NSFC gi 31400726 til ZWYW er finansiert av Young tusen talenter Program og Natural Science Foundation National of China (tilskudd 31471235 og 81422038). XY er finansiert av postdoktor Science Foundation of China (2015M571612).
High-fidelity DNA polymerase (Phusion High-Fidelity) with PCR buffer | New England Biolabs | M0530L | |
DNA ligase (T4 DNA ligase) | New England Biolabs | M0202L | |
Liposomal transfection reagent (Lipofectamine 2000) | Invitrogen | 11668-019 | |
Reduced serum medium (Opti-MEM) | Gibco | 31985-062 | |
RNA extraction buffer (TRIzol Reagent) | ambion | 15596018 | TRIzol reagent includes phenol, which can cause burns. Wear gloves when handling |
BSA (Bovine Serum Albumin) | Sigma-Aldrich | A7638-5G | |
PBS (1X) | Life Technologies | 10010-031 | |
SuperScript III reverse transcriptase | Invitrogen | 18080044 | |
Caspase-3 antibody | Cell Signaling Technology | 9668 | |
PARP antibody | Cell Signaling Technology | 9542 | |
Bcl-x antibody | BD Bioscience | 610211 | |
beta-actin antibody | Sigma-Aldrich | A5441 | |
alpha-tubulin antibody | Sigma-Aldrich | T5168 | |
FLAG antibody | Sigma-Aldrich | F4042 | |
Nitrocellulose membrane | Amersham-Pharmacia | RPN203D | |
ECL Western Blotting detection reagents | Invitrogen | WP20005 | |
Cy5-dCTP | GE Healthcare | PA55021 | |
Fluorescence-activated cell sorter | BD Bioscience | FACSCalibur | |
Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | GE Healthcare | SH30243.01 | |
Fetal bovine serum | Invitrogen | 26140079 | |
Propidium iodide (PI) | Sigma | P4170 | |
Bovine Serum Albumin (BSA) | Sigma | A7638-5G | |
Triton-X100 | Promega | H5142 | |
Poly-lysine | Sigma | P-4832 | Filter sterilize and store at 4 °C |
Vector pWPXLd | Addgene | 12258 | |
Vector pMD2.G | Addgene | 12259 | |
Vector psPAX2 | Addgene | 12260 | |
DNase I (RNase-free) | New England Biolabs | M0303S | |
Oligo(dT)18 Primer | Thermo Scientific | SO131 | |
Anti-mouse secondary antibody (Anti-mouse IgG, HRP-linked Antibody) | Cell Signaling Technology | 7076S |