足場リポソームを使用することにより、脂質近位タンパク質 - タンパク質相互作用を再構成します<em>インビトロ</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
インビトロでの内在性膜タンパク質の研究は、しばしば、疎水性膜貫通ドメインの存在によって複雑になります。さらに、これらの研究を複雑に、リポソームへの界面活性剤で可溶化膜タンパク質の再取り込みは、タンパク質のトポロジーが強制することは不可能である確率過程です。本稿では、リポソームベースの足場を利用し、これらの困難な技術に代わる方法を提供しています。タンパク質の溶解度は、膜貫通ドメインの欠失によって増強され、そしてこれらのアミノ酸は、Hisタグのように、つなぎ部分で置換されています。このテザーはアンカー基ニッケル（Ni 2+ Hisタグタンパク質についてニトリロ三酢酸（NTAニッケル（Ni 2+））によって調整）、リポソームの表面に均一なタンパク質のトポロジーを強制すると相互作用します。内在性膜タンパク質、ミトコンドリア分裂因子（MFF）とダイナミン関連タンパク質1（DRP1）の間の相互作用は、inveだった例が提示されますこの足場のリポソーム法を用いstigated。本研究では、効率的にそのGTPase活性を刺激したリポソームの表面に可溶性DRP1を募集するMFFの能力を実証しています。また、DRP1は、特定の脂質の存在下でMFF装飾脂質テンプレートをチューブ状にすることができました。この例では、構造的および機能的アッセイを用いて足場リポソームの有効性を実証し、DRP1活性の調節におけるMFFの役割を強調しています。
Introduction
膜近位のタンパク質-タンパク質相互作用を研究することにより、1関わる内在性膜タンパク質のネイティブ環境を反復するのが困難に挑戦し努力です。これは、界面活性剤可溶化およびプロテオリポソーム中のタンパク質の矛盾した姿勢の必要性に起因しています。これらの問題を回避するために、我々は、内在性膜タンパク質の可溶性ドメインは、Hisタグ融合タンパク質として発現させる戦略を採用しており、これらの可溶性断片は、脂質でNTAニッケル（Ni 2+）頭部基との相互作用を介して足場リポソームに固定されています表面。これらの足場を使用して、脂質近位タンパク質相互作用は、脂質およびタンパク質組成の範囲にわたって調べることができます。
我々は、ミトコンドリア分裂複合体のアセンブリを管理する重要なタンパク質 – タンパク質相互作用を調査し、このPRを調節する脂質との相互作用を調べるために、この方法を有効に適用していますocess 2。ミトコンドリア分裂の間、ダイナミン関連タンパク質1（DRP1）3と呼ばれる保存された膜のリモデリングタンパク質は、エネルギー恒常性、アポトーシスシグナル伝達、およびその他のいくつかを調節する細胞シグナルに応答してミトコンドリア外膜（OMM）の表面に補充され一体的なミトコンドリアのプロセス。 8 –この大規模な、細胞質ゾルのGTPアーゼは、一体のOMMタンパク質4との相互作用を介してミトコンドリアの表面に補充されます。そのようなタンパク質の役割、ミトコンドリア分裂因子（MFF）は、原因in vitroで DRP1と明らか弱い相互作用に解明することは困難でした。それにもかかわらず、遺伝学的研究は、MFFが成功したミトコンドリア分裂7,8に必須であることを実証しました。本稿に記載される方法は、DRP1、MFFの相互作用を促進し、同時に脂質相互作用を導入することによって、以前の欠点を克服することができました。全体的に、この新規アッセイreveaミトコンドリア分裂複合体の構築を導く基本的な相互作用を導き、この本質的な分子機械の継続的な構造的および機能的研究のための新たなステージを提供します。
現在までに、DRP1とMFFの間の相互作用の検討はMFF 9、DRP1ポリマー2,10、および精製することが困難と無傷の膜貫通ドメイン11と、全長MFFを再構成するの異質性の固有の柔軟性によって複雑にされています。私たちは、その膜貫通ドメイン（MffΔTM-彼の6）を欠いているHisタグMFFを再構成するNTA（ニッケル2+）足場リポソームを用いて、これらの課題に対処しました。 Eにおいて過剰発現された場合MffΔTMは非常に可溶であったため、この戦略が有利でした。大腸菌 、この単離されたタンパク質は、簡単に足場リポソームに再構成しました。これらの脂質のテンプレートに繋留すると、MFFは、膜の表面上の同一の、外向きの方向性を仮定しました。これらの利点に加えて、カルジオリピンのようなミトコンドリアの脂質は、膜11とMFFの折り畳みおよび会合を安定化させるために添加しました。カルジオリピンはまた、この無秩序地域を安定させ、核分裂機械の組み立てを容易にすることができるDRP1 2,12の可変ドメインと相互作用します。
このロバストな方法は、膜近位タンパク質相互作用を評価するために求める将来の研究のために広く適用可能です。追加のテザリング/親和性相互作用を使用することにより、これらの膜の再構成の研究の高度化は、細胞内の膜の表面で見出される付加的な複雑性を模倣するように拡張することができます。これと同時に、脂質組成物は、より正確に、これらの巨大分子複合体のネイティブ環境を模倣するように改変することができます。要約すると、この方法は、重要な細胞PROC中に膜形態を形成する上でのタンパク質及び脂質の相対的な寄与を検討するための手段を提供しますesses。
Protocol
Representative Results
Discussion
このプロトコルは、内在性膜タンパク質を含むタンパク質 – タンパク質相互作用を調査するための方法を提供しています。モジュラーリポソーム足場を利用することにより、研究者らは、脂質近位環境内の1つ以上のタンパク質の活性を評価することが可能です。 26 –これまでの研究は、原形質膜24の受容体酵素の同様の方法を実証しました。私たちは、脂質補因子を?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
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