Utilizzando impalcatura liposomi per ricostituire interazioni proteina-proteina lipidi-prossimale<em> In Vitro</em
Summary
This paper describes a method for assessing the interactions and assemblies of integral membrane proteins in vitro with various partner factors in a lipid-proximal environment.
Abstract
Studi di proteine integrali di membrana in vitro sono spesso complicata dalla presenza di un dominio transmembrana idrofobico. A complicare ulteriormente questi studi, reintegrazione delle proteine di membrana detergente-solubilizzato in liposomi è un processo stocastico in cui topologia di proteine è impossibile da far rispettare. Questo articolo offre un metodo alternativo per queste tecniche impegnative che utilizza un ponteggio a base di liposomi. Protein solubilità è esaltata dalla delezione del dominio transmembrana, e questi amminoacidi sono sostituiti con un residuo tethering, ad esempio un His-tag. Questo tether interagisce con un gruppo di ancoraggio (Ni 2+ coordinato da acido nitrilotriacetico (NTA (Ni 2+)) per His-tag proteine), che impone una topologia proteine uniforme sulla superficie del liposoma. Un esempio è presentato in cui l'interazione tra proteine Dynamin legati 1 (DRP1) con una proteina integrale di membrana, mitocondriale fissione Factor (QFP), era investigated utilizzando questo metodo impalcatura liposomi. In questo lavoro, abbiamo dimostrato la capacità di QFP di reclutare in modo efficiente DRP1 solubile alla superficie dei liposomi, che ha stimolato la sua attività GTPasi. Inoltre, DRP1 era in grado di tubulate il modello di lipidi MFF-decorato in presenza di lipidi specifici. Questo esempio dimostra l'efficacia di liposomi impalcature utilizzando saggi strutturali e funzionali e mette in evidenza il ruolo del QFP nella regolazione dell'attività DRP1.
Introduction
Studiare le interazioni proteina-proteina di membrana-prossimale è uno sforzo impegnativo a causa della difficoltà di ricapitolare l'ambiente nativo delle proteine integrali di membrana coinvolte 1. Ciò è dovuto alla necessità di detersivo solubilizzazione e l'orientamento incoerente delle proteine in proteoliposomi. Per evitare questi problemi, abbiamo utilizzato una strategia quale i domini solubili di proteine integrali di membrana sono espressi come proteine di fusione His-tag, e questi frammenti solubili sono ancorati liposomi ponteggio tramite interazioni con NTA (Ni 2+) headgroups al lipide superficie. L'utilizzo di questi ponteggi, interazioni proteina-lipidi prossimale possono essere indagati in un intervallo di lipidi e proteine composizioni.
Abbiamo effettivamente applicato questo metodo per studiare le interazioni critiche proteina-proteina che regolano il montaggio del complesso fissione mitocondriale ed esaminare le interazioni lipidi che modulano questo process 2. Durante la fissione mitocondriale, una conservata proteina rimodellamento della membrana, chiamata Dynamin-related protein 1 (DRP1) 3, viene reclutato per la superficie del mitocondriale esterna della membrana (OMM) in risposta a segnali cellulari che regolano l'omeostasi energetica, segnale apoptotico, e molti altri processi mitocondriali integrali. Questo grande, GTPase citosolica viene reclutato alla superficie dei mitocondri attraverso le interazioni con proteine OMM integrali 4 – 8. Il ruolo di una tale proteina, mitocondriale fissione Factor (QFP), è stato difficile chiarire causa di una debole interazione evidente con DRP1 in vitro. Tuttavia, studi genetici hanno chiaramente dimostrato che QFP è essenziale per il successo 7,8 fissione mitocondriale. Il metodo descritto in questo manoscritto è stato in grado di superare le carenze precedenti introducendo le interazioni lipidi simultanee che promuovono le interazioni DRP1-QFP. Nel complesso, questo nuovo metodo di analisi REVEAportato interazioni fondamentali che guidano il montaggio del complesso fissione mitocondriale e ha fornito una nuova fase per gli studi strutturali e funzionali in corso di questa macchina molecolare essenziale.
Fino ad oggi, l'esame delle interazioni tra DRP1 e QFP sono state complicate dalla flessibilità intrinseca del QFP 9, l'eterogeneità dei polimeri DRP1 2,10, e la difficoltà di purificazione e di ricostituzione full-length QFP con un dominio transmembrana intatto 11. Abbiamo affrontato queste sfide utilizzando liposomi NTA (Ni 2+) ponteggio per ricostituire His-tag QFP manca il suo dominio transmembrana (MffΔTM-His 6). Questa strategia è stata vantaggioso perché MffΔTM era estremamente solubile quando sovra-espresso in E. coli, e questa proteina isolata è stato facilmente ricostituiti in liposomi patibolo. Quando legato a questi modelli di lipidi, MFF ha assunto un identico, rivolto verso l'esterno orientamento sulla superficie della membrana.Oltre a questi vantaggi, lipidi mitocondriali, come cardiolipina, sono stati aggiunti per stabilizzare QFP piegatura e di associazione con la membrana 11. Cardiolipin interagisce anche con il dominio variabile della DRP1 2,12 che può stabilizzare questa regione disordinato e facilitare il montaggio della macchina fissione.
Questo metodo robusto è ampiamente applicabile per gli studi futuri che cercano di valutare le interazioni delle proteine di membrana-prossimale. Attraverso l'uso di ulteriori interazioni tethering / affinità, la sofisticazione di questi studi ricostituzione membrana può essere migliorato per imitare ulteriori complessità trovato alla superficie delle membrane all'interno delle cellule. Allo stesso tempo, composizioni lipidiche possono essere modificati per imitare più accuratamente gli ambienti nativi di questi complessi macromolecolari. In sintesi, questo metodo fornisce un mezzo per esaminare i relativi contributi di proteine e lipidi nel plasmare morfologie membrana a durante proc cellulare criticaesses.
Protocol
Representative Results
Discussion
Questo protocollo offre un metodo per studiare le interazioni proteina-proteina che coinvolgono proteine integrali di membrana. Utilizzando un ponteggio liposoma modulare, investigatori sono in grado di valutare l'attività di una o più proteine in un ambiente lipidico-prossimale. Studi precedenti hanno dimostrato un metodo simile per gli enzimi del recettore della membrana plasmatica 24 – 26. Abbiamo ampliato questo metodo per incorporare cofattori lipidici ed esplorare…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
The authors would like to acknowledge the funding received from the American Heart Association (SDG12SDG9130039).
Materials
| Phosphatidylcholine (DOPC) | Avanti Polar Lipids | 850375 | |
| Phosphatidylethanolamine (DOPE) | Avanti Polar Lipids | 850725 | |
| DGS-NTA(Ni2+) | Avanti Polar Lipids | 790404 | |
| Bovine Heart Cardiolipin (CL) | Avanti Polar Lipids | 840012 | |
| Chloroform | Acros Organics | 268320010 | |
| Liposome Extruder | Avanti Polar Lipids | 610023 | |
| Cu/Rh Negative Stain Grids | Ted Pella | 79712 | |
| Microfuge Tube | Beckman | 357448 | |
| GTP | Jena Biosciences | NU-1012 | |
| GMP-PCP | Sigma Aldrich | M3509 | |
| Microtiter Plate strips | Thermo Scientific | 469949 | |
| EDTA | Acros Organics | 40993-0010 | |
| Instant Blue Coomassie Dye | Expedeon | ISB1L | |
| HEPES | Fisher Scientific | BP310 | |
| BME | Sigma Aldrich | M6250 | |
| KCL | Fisher Scientific | P330 | |
| KOH | Fisher Scientific | P250 | |
| Magnesium Chloride | Acros Organics | 223211000 | |
| 4-20% SDS-PAGE Gel | Bio Rad | 456-1096 | |
| 4x Laemmli Loading Dye | Bio Rad | 161-0747 | |
| HCL | Fisher Scientific | A144S | |
| Malachite Green Carbinol | Sigma Aldrich | 229105 | |
| Ammonium Molybdate Tetrahydrate | Sigma Aldrich | A7302 | |
| Laboratory Film | Parafilm | PM-996 | |
| Uranyl Acetate | Polysciences | 21447 | |
| Tecnai T12 100 keV Microscope | FEI | ||
| Optima MAX | Beckman | ||
| TLA-55 Rotor | Beckman | ||
| Refrigerated CentriVap Concentrator | Labconico | ||
| Mastercycler Pro Thermocycler | Eppendorf | ||
| VersaMax Microplate reader | Molecular Devices |
References
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