단일 분자 힘 분광학을 사용하여 무기 재료와 아미노산 및 펩타이드의 상호 작용에 대한 통찰력
Summary
여기서 우리는 원 자간 력 현미경 (AFM)을 사용하여 단일 분자 힘 분광법 측정에 의해 잘 정의 된 무기 표면 중 펩티드 또는 아미노산의 상호 작용의 힘을 측정하기위한 프로토콜을 제시한다. 측정으로부터 얻어진 정보는 더 펩타이드 무기물 계면을 이해하는 것이 중요하다.
Abstract
단백질이나 펩티드 및 무기 물질 사이의 상호 작용은 몇 가지 흥미로운 프로세스로 이어집니다. 예를 들어, 미네랄 단백질을 결합하는 독특한 성질을 갖는 복합 재료의 형성을 이끈다. 또한,의 생물 연료의 바람직하지 못한 프로세스는 표면에 생체 분자를 주로 단백질의 흡착에 의해 개시된다. 유기층은 박테리아 접착층이고 이들 표면과 상호 작용할 수있다. 유기 – 무기 계면에서의 상호 작용을 지배하는 근본적인 힘을 이해하는 것은 연구의 많은 지역을위한 것이 중요하고, 광학 기계 및 생명 의학 애플리케이션을위한 새로운 재료의 설계가 발생할 수 있습니다. 이 논문은 펩타이드 또는 아미노산 및 잘 정의 된 무기 표면 중 하나 사이의 접착력을 측정하기 위해 AFM을 이용하는 단일 분자 힘 분광 기법을 보여준다. 이 기술은 AFM에 생체 분자를 부착하기위한 프로토콜을 포함원자력 현미경에 의해 공유가요 성 링커 및 단일 분자 힘 스펙트럼 측정을 통한 팁. 또한, 이러한 측정 분석이 포함된다.
Introduction
단백질과 무기 미네랄 간의 상호 작용은 특유의 특성을 가진 복합 재료의 구성을 이끈다. 이것은 높은 기계적 강도 또는 고유 광학 특성을 갖는 물질을 포함한다. 예를 들어 1, 2, 미네랄 하이드 록시 아파타이트와 단백질 콜라겐의 조합은 서로 다른 기능을위한 연질 또는 경질의 뼈를 생성한다. 3 짧은 펩티드는 높은 특이성과 무기 물질을 바인딩 할 수 있습니다. 도 4를 참조하면, 이러한 펩티드 5, 6 특이성이 결정 9는 나노 물질의 제조, 8, 7, 새로운 자기 및 전자 재료를 설계 성장에 사용 된 (10)와 합성 나노 입자. 11 그러므로 우리가 개선 된 흡착 특성을 가진 새로운 복합 재료를 설계 할 수 펩타이드 또는 단백질과 무기 물질 사이의 상호 작용을 기본 메커니즘을 이해. 면역 반응과 임플란트의 계면이 단백질에 의해 매개되기 때문에 또한, 더 나은 무기 물질과 단백질의 상호 작용을 이해하는 것이 임플란트를 설계 할 수있는 능력이 향상됩니다. 무기 표면과 상호 작용하는 단백질을 포함하는 또 다른 중요한 영역 방오 재료의 제조이다. 12, 13, 14, 15은 생 오손 생물이 표면에 부착 한 바람직하지 않은 방법이다. 그것은 우리의 삶에 많은 부정적인 의미를 가지고있다. 예를 들어, 의료 기기에 대한 세균의 생물 연료는 병원 획득 감염으로 이어집니다. 보트와 대형 선박에 해양 생물의 생 오손은 증가 연료의 소비. 12, 16, 17, 18
단일 분자 힘 분광법 (SMFS)는 원자 현미경을 사용하여, 직접, 아미노산 또는 펩티드와 기판 사이의 상호 작용을 측정 할 수있다. 이러한 파아지 디스플레이, 27 (28) 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26 다른 방법 석영 크리스탈 마이크로 저울 (QCM) (29) 표면 플라스 몬 공명 (SPR) 29, 30, 31, 32,심판 "> (33) 측정 대량의 무기 표면에 펩타이드와 단백질의 상호 작용. 34, 35, 36 그러면 이러한 방법에 의해 얻어진 결과는 분자 또는 응집체의 앙상블에 관한 것을 의미한다. SMFS에서 하나 또는 소수의 분자는 AFM 팁에 고정되고, 원하는 기판과의 상호 작용을 측정한다. 이 방법은 표면으로부터 단백질을 당겨 단백질 접힘 학습하도록 확장 될 수있다. 또한, 세포와 단백질과 그 리간드에 대한 항체의 결합 상호 작용을 측정하는데 사용될 수있다. 37, 38, 39, 40이 논문은 실라 화학 제를 사용하여 AFM 팁에 펩티드 또는 아미노산 중 하나를 부착하는 방법을 상세히 설명한다. 또한, 종이는 힘의 측정을 수행하는 방법 및 분석 방법을 설명결과.
Protocol
1. 팁 수정 구매 질화 규소 (Si3N4), 실리콘 팁 AFM 캔틸레버 (~ 2 nm 인 캔틸레버 공칭 반경). 20 분 동안 무수 에탄올에 침지하여 각 AFM 캔틸레버를 청소합니다. 실온에서 건조. 그런 다음 5 분 동안 O 2 플라즈마에 노출시킴으로써, 캔틸레버를 처리한다. (15)의 비율 (3cm) 용액을 함유하는 메틸 트리에 톡시 실란 및 3- (아미노 프로필) 트리에 톡시 실란을 상?…
Representative Results
도 1은 선단부 수정 방법을 나타낸다. 첫 번째 단계에서, 플라즈마 처리는, 질화 실리콘 팁의 표면을 변화시킨다. 끝은 OH 그룹을 제공합니다. 이러한 그룹은 실란과 반응한다. 이 단계의 마지막에, 팁의 표면 자유 -NH 2 그룹에 포함된다. 이러한 유리 아민은 FMOC -PEG-NHS, 공유 링커와 반응 할 것이다. 페그 링커 FMOC 그룹 pipyridine, 탈 보호 시약을 제거한다. …
Discussion
프로토콜에서 1.3, 1.4 및 1.7의 광범위한 치료에 매우 부드러운 방식으로 수행되어야 단계. 단계 130에서, 팁 실란 혼합물 실란 화 과정이 불활성 대기 (수분이 없음)에서 수행되어야 접촉이어야한다. (45) 이것은 적층 형성을 방지하기 위하여 실란 분자가 쉽게 수분의 존재하에 가수 분해를 받아야하기 때문에 수행된다. (45)
단계 140에서, 온도…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This work was supported by the Marie Curie International Reintegration Grant (EP7). P. D. acknowledges the support of the Israel Council for Higher Education.
Materials
| Silicon nitride (Si3N4) AFM cantilevers with silicon tips | Bruker (Camarilo, CA, USA) | MSNL10, nominal cantilevers radius ~2 nm | |
| Methyltriethoxysilane | Acros Organics (New Jersey, USA) | For Silaylation of the AFM tip | |
| 3-(Aminopropyl) triethoxysilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
| Triisopropylsilane | Sigma-Aldrich (Jerusalem, Israel) | Used for tip modification | |
| N-Ethyldiisopropylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Triethylamine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Piperidine | Alfa-Aesar (Lancashire, UK) | Used for tip modification | |
| Fluorenylmethyloxycarbonyl-PEG-N-hydroxysuccinimide (Fmoc-PEG-NHS) | Iris Biotech GmbH (Deutschland, Germany) | Used as the covalent flexible linker (MW = 5000 Da) | |
| 2-(1H-benzotriazol-1-yl)-1,1,3,3,-tetramethyluronium hexafluorophosphate (HBTU) | Alfa Aser (Heysham, England) | Used as a coupling reagent. | |
| N-methyl-2-pyrrolidone (NMP) | Acros Organics (New Jersey, USA) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| DMF (dimethylformamide) | Merck (Darmstadt, Germany) | Used as Solvent in Tip modification procedure | |
| Trifluoro acetic acid (TFA) | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Acetic anhydride | Merck (Darmstadt, Germany) | ||
| Peptides | GL Biochem (Shanghai, China). | ||
| Phenylalanine and Tyrosine | Biochem (Darmstadt, Germany) | ||
| 30% TiO2 dispersion in the mixture of solvent 2-(2-Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | Applied Vision Laboratories (Jerusalem, Israel) | (30%) in the mixture of solvent 2-(2 Methoxyethoxy) ethanol (DEGME) and Ethyl 3-Ethoxypropionate (EEP) | |
| Mica substrates | TED PELLA, INC. (Redding, California, USA) | 9.9 mm diameter |
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Citer Cet Article
Das, P., Duanias-Assaf, T., Reches, M. Insights into the Interactions of Amino Acids and Peptides with Inorganic Materials Using Single-Molecule Force Spectroscopy. J. Vis. Exp. (121), e54975, doi:10.3791/54975 (2017).