Dans la maladie de Parkinson (PD), substantia nigra (SNC) neurones dopaminergiques dégénèrent, entraînant un dysfonctionnement du moteur. Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d'une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de tyrosine-hydroxylase (TH), la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome en utilisant l'ARN-seq.
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Article de méthode
Identification fiable de la vie Neurones Dopaminergiques dans les cultures Mésencéphale utilisant l'ARN Séquençage et TH-promoteur-driven eGFP Expression
Dans cet article
Résumé
Résumé
Dans la maladie de Parkinson (PD), il y a une perte neuronale répandue dans le cerveau avec une dégénérescence marquée des neurones dopaminergiques dans le snc, conduisant à la bradykinésie, la rigidité et les tremblements. L'identification des neurones dopaminergiques vivant dans ventral mésencéphalique (VM) des cultures primaires en utilisant un marqueur fluorescent fournit une autre façon d'étudier la vulnérabilité sélective de ces neurones sans compter sur la immunocoloration des cellules fixes. Ici, nous isoler, dissocier, et les neurones VM de souris de culture pendant 3 semaines. Nous identifions alors les neurones dopaminergiques dans les cultures en utilisant eGFP fluorescence (entraînée par un promoteur Tyrosine hydroxylase (TH)). neurones individuels sont récoltés dans des tubes à centrifuger à l'aide de micropipettes de verre. Ensuite, nous Lyse des cellules récoltées, et nous effectuons la synthèse d'ADNc et transposon médiée "tagmentation" pour produire seule cellule ARN-Seq bibliothèques 1, 2,ass = "xref"> 3, 4, 5. Après avoir passé une vérification de contrôle de qualité, les bibliothèques unicellulaires sont séquencées et l'analyse ultérieure est réalisée pour mesurer l'expression génique. Nous présentons les résultats transcriptome pour dopaminergique individuel et neurones GABAergiques isolés à partir de cultures mésencéphale. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP qui ont été recueillies et ont été séquencées neurones dopaminergiques. Ces techniques auront des applications répandues dans les neurosciences et la biologie moléculaire.
Introduction
Maladie de Parkinson (PD) est une maladie incurable liée à l'âge neurodégénérative. La cause de ce trouble relativement courant reste mal comprise. Il y a une perte généralisée des neurones dans le cerveau, avec la dégénérescence neuronale prononcée des neurones dopaminergiques dans la substantia nigra (SNC), conduisant à des caractéristiques cliniques de diagnostic de la bradykinésie, la rigidité et les tremblements.
cultures mixtes primaires contenant des neurones dopaminergiques SNc sont particulièrement pertinents pour la maladie de Parkinson. Ventral tegmentale Area (VTA) neurones dopaminergiques ont été impliqués dans la récompe....
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Protocole
NOTE: Toutes les expériences ont été menées en conformité avec les lignes directrices pour les soins et l'utilisation des animaux fournis par les National Institutes of Health, et des protocoles ont été approuvés par le Comité soin et l'utilisation institutionnelle des animaux à l'Institut de Technologie de Californie.
1. Dérivation de dopaminergiques primaire Cultures cellulaires de cerveau embryonnaire de souris
- Solutions et Culture Medium
- Préparation de l'acide ascorbique Stock Solution
- Peser 352 mg d'acide ascorbique. Ajouter la lettre H 2 O stérile jusqu'à un volume tota....
- Préparation de l'acide ascorbique Stock Solution
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Résultats
Nous rapportons ici un protocole pour la culture de neurones mésencéphaliques ventraux provenant d' une souris exprimant eGFP entraînée par une séquence de promoteur de la tyrosine hydroxylase, la récolte des neurones fluorescents individuels à partir des cultures, et en mesurant leur transcriptome d'ARN en utilisant l' ARN-seq (figure 1). Les données montrent que 100% des cellules TH-EGFP-positives qui ont été récoltés et séquencés sont des neurones dopaminergiques, bas.......
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Discussion
Ici, nous isolons des cellules individuelles à partir d'une population hétérogène utilisant un marqueur fluorescent, puis étudier chaque cellule avec une seule cellule ARN-seq. Nous avons constaté que 100% des cellules vivantes TH-eGFP que nous récoltés et séquencés étaient neurones dopaminergiques en effet, en fonction de la présence des trois transcrits du gène DA liées suivantes, TH, DDC et SLC6A3. Toutes les cellules positives TH-eGFP ont exprimé ces trois gènes évalués par l'ARN-Seq. Cela a été concordant a.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n’ont rien à divulguer.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par des subventions des National Institutes of Health des États-Unis (DA017279, AG033954, DA037743), de la Fondation Michael J. Fox et de la Caltech Innovation Initiative finançant le laboratoire de génétique et de génomique Millard et Muriel Jacobs du California Institute of Technology. Nous remercions Brian Williams d’avoir optimisé le protocole de la bibliothèque RNA-Seq et de nous avoir fourni de l’aide. Nous remercions Henry Amrhein pour la formation informatique. Nous remercions Barbara J. Wold pour l’utilisation de son équipement et de son espace de laboratoire. Nous remercions Igor Antoshechkin pour le séquençage de la bibliothèque et ....
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Papain Worthington Biochemical Corporation ; | |||
| solution saline équilibrée en écheveaux (HBSS), 1x | Gibco ; | 14175-095 | |
| Sérum équin | donneur Thermo Scientific ; | SH30074.03 | |
| Albumine sérique bovine (BSA) | Sigma ; | A7030-50G | |
| Milieu : Milieu neurobasal | Gibco ; | 21103-049 | |
| Milieux de culture contenant une forme stabilisée de L-glutamine, L-alanyl-L-glutamine : GlutaMAX | Gibco ; | 35050-061 | Concentration finale de 0,5 mM. |
| Acide L-ascorbique | Sigma ; | A7506 | |
| B27 | Gibco ; | 17504-044 | 50x solution mère, 1x concentration finale. |
| Plats à fond en verre de 35 mm | MatTek· ; | P35GC-1.5-10-C | |
| Poly-L-Ornithine | Sigma ; | P4957 | |
| Laminine | Sigma ; | L2020 | Stocké à -20 ° ; C en 20 & micro ; L aliquotes |
| Déoxyribonucléase I (DNase) | Sigma ; | DN25 | |
| Pointes de pipette bleues P1000 | Sorenson Bioscience | ;Inc. 10130 | |
| Boîte de Pétri peu profonde de 10 mm | VWR ; | 25384-324 | |
| 37 ° ; C Bain-marie | |||
| 37 ° ; C, incubateur | |||
| 16 % de paraformaldéhyde (PFA) | Microscopie électronique Sciences ; | 15710 | |
| Triton X-100 | Sigma | ; X100-500ML | |
| Sérum d’âne | Equitech ; | SD-0100HI | Solution mère à 100 %, concentration finale de 1 %. |
| Ciseaux chirurgicaux à modèle standard | Outils de science fine | 14000-14 | |
| Pince - 2x3 dents | Outils de science fine | 11022-14 | |
| Pince - Dumont #55 | Outils de science fine | 11295-51 | |
| Pince - Dumont #5 | Outils de science fine | 11252-23 | |
| 10x PBS, pH 7,4 | Gibco ; | 70011-044 | |
| Solution tamponnée au phosphate (DPBS) de Dulbecco 1x | Gibco | 14190-144 | 500 mL |
| Aiguille 21 G | BD PrecisionGlide Aiguille | 305167 | 100 aiguilles |
| Extracteur de micropipette | Sutter Instrument | modèle P-87 | |
| Micromanipulateur ; | Instrument Sutter | ; Kit de séquençage MP-285 | |
| : Kit SMARTer Ultra Low RNA pour séquençage Illumina | Clontech | 634936 | 100 rnxs, y compris le kit Advantage2PCR |
| oligonucléotide (12 µ ; M) : oligonucléotide SMARTer IIA (12 µ ; M) | Du kit SMARTer ; | ||
| Transcriptase inverse (100 unités) | SMARTcribe Transcriptase | inverse du kit SMARTer ; | |
| Apprêt 1 | 3' CDSIIa primer ; | Du kit SMARTer | |
| Primer 2 | IS Amorce | PCR Du kit SMARTer | |
| 50x 2 mélange de polymérase | 50x Advantage 2 mélange | Du kit SMARTer | |
| 10x tampon PCR | 10x Advantage 2 Tampon | PCR Du kit SMARTer | |
| Pointes d’ARN | ThermoFisher | 4456740 | |
| Rack de refroidisseur | PCR IsoFreeze | ||
| Kit de préparation d’échantillons d’ADN ; | (Illumina/Nextera) Nexter | FC-121-1030 | 24 échantillons |
| Mélange maître PCR | Nextera (NPM) | Du kit Nextera ; | |
| Cocktail d’amorces PCR (PPC) | Nextera PCR primer cocktail (PPC) ; | Du kit Nextera | |
| Fluorimètre | Le kit Qubit ThermoFisher | Q33216 | |
| HS BioAnalyzer | Agilent | 5067-4626 | 110 rxns |
| Système d’électrophorèse ; | Bioanalyseur Agilent 2100. | G2938C | |
| Perles magnétiques : Agencourt AMPure ; | Beckman Coulter | A63880 | 5 mL |
| Lingette RNAse : Lingettes RNAse Zap | Ambion | AM9786 | Taille 100 Feuilles |
| Qubit ds HS Assay Kit | Sondes moléculaires ; | Q32854 | 500 dosages |
| Kit d’extraction de gel : Qiaquick Kit d’extraction de gel | Qiagen ; | 28704 | |
| Tube capillaire en verre | (Kimax-51, 1,5 - 1,8 mm de diamètre extérieur) | ||
| Microforge | Narishige (ou équivalent) ; | ||
| Séquenceur | Illumina HiSeq instrument | ||
| GENSAT tyrosine hydroxylase-eGFP souche de souris ; | Numéro de stock MMRRC : 000292-UNC | Stock Tg(Th-EGFP)DJ76Gsat/Mutant Mouse Regional Research Center |
Références
- Henley, B. M., et al. Transcriptional regulation by nicotine in dopaminergic neurons. Biochem Pharmacol. 86 (8), 1074-1083 (2013).
- Marinov, G. K., et al. From single-cell to cell-pool transcriptomes: stochasticity in gene expression and ....
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Réimpressions et autorisations
