Co-Lokalisierung von Zell Lineage Marker und die Tomate Signal
Summary
Wir entwickelten zwei Sätze von Kombinationen in Rosa26 tdTomato Tracing (ubiquitär in allen Zellen exprimiert) / Cre (insbesondere in Chondrozyten exprimiert) Mäuse: eine mit 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und eine mit Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen die direkte Umwandlung von Chondrozyten in Knochenzellen.
Abstract
Die Zelllinie Tracing-System wurde in erster Linie in der Entwicklungsbiologie Studien verwendet. Die Verwendung von Cre-Rekombinase erlaubt die Aktivierung des Reporters in einer bestimmten Zelllinie und alle Nachkommen. Hier haben wir die Zelllinie Tracing – Technik verwendet , um nachzuweisen , dass Chondrozyten direkt verwandeln sich in Osteoblasten und Osteozyten während der langen Knochen und Kiefergelenkkopfs Entwicklung unter Verwendung von zwei Arten von Cre, Col10a1-Cre und Aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), gekreuzt mit Rosa26 tdTomato. Sowohl Col10 und Aggrecan sind gut erkannt Marker für Chondrozyten.
Auf dieser Basis haben wir eine neue Methode-cell lineage in Verbindung mit fluoreszierenden Immunhistochemie-to Verfolgungszellschicksal bestimmen, indem die Expression von spezifischen Zellmarkern analysiert. Runx2 (ein Marker für osteogene Zellen im Frühstadium) und Dentinmatrix protein1 (DMP1; ein Marker für osteogene Zellen im Spätstadium) warenverwendet, um Chondrozyten stammende Knochenzellen und deren Differenzierungsstatus zu identifizieren. Diese Kombination erweitert nicht nur die Anwendung von Zelllinie Verfolgung, sondern vereinfacht auch die Erzeugung von Verbindung Mäusen. Noch wichtiger ist, sind die Anzahl, Position und Differenzierung Status der Mutterzelle Nachkommen gleichzeitig angezeigt, Tracing allein mehr Informationen als Zelllinie bereitstellt. Abschließend ist die Co-Anwendung von Zelllinie Verfolgungstechniken und Immunofluoreszenz ein mächtiges Werkzeug der Zellbiologie in vivo zu untersuchen.
Introduction
Während der Entwicklung Konten endochondral Knochenbildung für mehr als 80% des Skelettvolumen. Es wird allgemein angenommen, dass es mit der Apoptose von hypertrophen Chondrozyten beginnt. Anschließend dringen in die Zellen von der darunter liegenden Knochenmark und initiieren Angiogenese, gefolgt von einer Knochenneubildung durch aus Knochenmark und Periost-abstammenden Zellen 1,2. Die Zelle Schicksal von hypertrophen Chondrozyten (HC-) jedoch seit Jahrzehnten 3 eine Frage der Debatte. Zunächst wurden HCs als das Ende der Chondrozyten-Differenzierungsweges zu sein, und wurde Apoptose allgemein das endgültige Schicksal der HCs zu denken. Jetzt schlagen einige Forscher, dass zumindest einige HCs überleben könnten und tragen zur enchondralen Knochenbildung. Obwohl sie , dass das Wachstum Platte Chondrozyten hatte die Fähigkeit , in Osteoblasten auf Ultra, immunhistochemischen Färbung und in vitro basierend auf transdifferentiate vorgeschlagenen Studien 46, keine dieser Methoden wehe endgültige Chondrozyten Beitrag zur Osteoblasten-Linie zu demonstrieren.
Die Zelllinie Tracing-Technik liefert eine strengere Weise Zellschicksal zu studieren. Kurz gesagt, eine Rekombinase-Enzym, das nur in einem bestimmten Zelltyp exprimiert wird, stimuliert die Expression des Reportergens. Auf diese Weise kann diese Art von Zelle und ihre Nachkommen sind 7 dauerhaft markiert. Das Cre-loxP-System wird häufig in Lineage Tracing verwendet. Cre (die Rekombinase – Enzym) wird die STOP – Sequenz zwischen den zwei loxP – Stellen und aktivieren Sie den Reporter in einer bestimmten Zelllinie (Abbildung 1A) auszuschneiden. In einigen Fällen kann der Prüfer einen günstigen Zeitpunkt wählen Cre zur Aktivierung durch ein Medikament, wie Tamoxifen verwendet, Cre was bewirkt , daß eine modifizierte Form des Östrogenrezeptors (Cre ERT2) 8 zu verschmelzen. Fluorescent Reporter haben die Standard-in-Linie Tracing-Experimente geworden, weil sie drastisch die Komplexität reduzierenund verbessern die Genauigkeit und Effizienz des Zellschicksals Tracing 8,9. tdTomato wird immer die beste Wahl unter den fluoreszierenden Reportern , da es die hellsten fluoreszierende Protein und das stärkste Epifluoreszenz- hat, so dass es leicht 7 (Abbildung 1A) sichtbar gemacht .
Durch die Nutzung der Rosa26 tdTomato Linie Tracing – System, unsere Gruppe und andere Forscher gezeigt , dass HCs ihren Phänotyp in Knochenzellen während der Entwicklung 10 bis 14 ändern. Um dies zu erreichen, entwickelten wir zwei Sätze von Kombinationen mit Rosa26 tdTomato (ubiquitäre Expression in allen Zellen) / Cre (spezifisch für Chondrozyten) -Mäuse Tracing: 2.3Col1a1-GFP (spezifisch für Osteoblasten) und Immunofluoreszenz (spezifisch für Knochenzellen). Die Daten zeigen , dass beide Methoden sind gangbare Wege des Zellschicksals in vivo zu untersuchen.
Protocol
Representative Results
Discussion
Aufgrund der technologischen Einschränkungen , ist es immer schwierig , das Verhalten von Zellen in vivo zu untersuchen. Allerdings erweist sich die Zelllinie Tracing – Technik für das Studium der Zellbiologie 7-9 ein mächtiges Werkzeug zu sein. In dieser Studie, verbessern wir weiter dieses Protokoll indem sie sie mit Immun kombiniert. Auf diese Weise kann das Zellschicksal von mehreren verwandten Marker definiert werden, die die Anwendung von Lineage Tracing erweitert. Darüber hinaus ist diese …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
