Samlokalisering av Cell Lineage Markører og tomat Signal
Summary
Vi utviklet to sett med sporing kombinasjoner i Rosa26 tdtomato (overalt uttrykt i alle celler) / Cre (spesielt uttrykt i chondrocytes) mus: en med 2.3Col1a1-GFP (spesifikke for osteoblaster) og ett med immunfluorescens (spesifikke for beinceller). Dataene viser den direkte transformasjon av kondrocytter inn i beinceller.
Abstract
Cellen avstamning tracing system har vært brukt hovedsakelig i utviklingsbiologi studier. Bruken av Cre rekombinase gjør det mulig for aktivering av reporter i en spesifikk cellelinje og alt avkom. Her brukte vi cellen avstamning tracing teknikk for å vise at chondrocytes direkte forvandle seg til osteoblaster og osteocytter under lange bein og kjeve knokkelen utvikling ved hjelp av to typer Cre, Col10a1-Cre og aggrecan-Cre ERT2 (Agg-Cre ERT2), krysset med Rosa26 tdTomato. Både Col10 og aggrecan er godt anerkjent markører for chondrocytes.
På bakgrunn av dette, har vi utviklet en ny metode-celle avstamning sporing i forbindelse med fluorescerende immunhistokjemi å definere celle skjebne ved å analysere uttrykket av spesifikke cellemarkører. Runx2 (en markør for tidlig stadium osteogene celler) og Dentin matrise protein1 (DMP1, en markør for sent stadium osteogene celler) varanvendes for å identifisere kondrocytt-avledede beinceller og deres differensiering status. Denne kombinasjonen er ikke bare utvider anvendelsen av cellen avstamning tracing, men forenkler også generering av sammensatte mus. Enda viktigere er de nummer, beliggenhet, og differensierings statusene foreldrecellen avkom vises samtidig, noe som gir mer informasjon enn celle avstamning sporing alene. I konklusjonen, co-anvendelse av cellen avstamning sporing teknikker og immunfluorescens er et kraftig verktøy for å undersøke cellebiologi in vivo.
Introduction
Under utviklingen utgjør endochondral bendannelse for over 80% av skjelettvolum. Det er en utbredt oppfatning at det begynner med apoptose av hypertrofiske chondrocytes. Deretter ble cellene fra den underliggende benmarg invadere og sette i gang angiogenese, etterfulgt av nytt ben avsetning av ben marrow- og periosteum-avledede celler 1,2. Cellen skjebne hypertrofiske chondrocytes (HC'er), derimot, har vært et problem for debatt i flere tiår 3. Til å begynne med ble HC'er ansett for å være den ende av kondrocytt differensiering vei, og apoptose ble generelt antatt å være den endelige skjebnen til HC'er. Nå, noen forskere antyder at i det minste noen HC'er kunne overleve og bidra til endochondral beindannelse. Selv om de foreslås at veksten plate chondrocytter hadde evnen til å transdifferentiate inn i osteoblaster basert på ultrastruktur, immunhistokjemisk farging, og in vitro studier 46 Ingen av disse metodene were definitive demonstrere chondrocyttransplantasjon bidrag til osteoblast avstamning.
Cellen avstamning tracing teknikk gir en mer grundig måte å studere celle skjebne. I korthet sett, en rekombinase enzym, som bare uttrykkes i et bestemt type celler, stimulerer ekspresjonen av reportergenet. På denne måten blir denne type celle og deres etterkommere permanent merket 7. Den Cre-loxP system er vanligvis brukes i avstamning sporing. Cre (den recombinase enzym) vil eksisere STOP sekvens mellom de to loxP-seter og aktivere reporter i en bestemt cellelinje (figur 1A). I noen tilfeller kan undersøkeren velge et gunstig tidspunkt for å aktivere Cre ved hjelp av et stoff, slik som tamoxifen, forårsaker Cre til å smelte til en modifisert form av østrogenreseptoren (Cre ERT2) 8. Fluorescent journalister har blitt standard i avstamning tracing eksperimenter fordi de dramatisk redusere kompleksitetenog forbedre nøyaktigheten og effektiviteten av celle skjebne sporing 8,9. tdTomato blir det beste valget blant fluorescerende reportere siden det har den lyseste fluorescerende protein og den sterkeste epifluorescence, noe som gjør det enkelt visualisert 7 (figur 1A).
Ved hjelp av Rosa26 tdTomato avstamning sporing system, har vår gruppe og andre forskere vist at HC'er kan endre sin fenotype til beinceller under utvikling 10-14. For å oppnå dette, har vi utviklet to sett med tracing kombinasjoner med Rosa26 tdtomato (allestedsnærværende ekspresjon i alle celler) / Cre (spesifikk til kondrocytter) mus: 2.3Col1a1-GFP (spesifikk til osteoblaster) og immunfluorescens (spesifikk til benceller). Dataene viser at begge metoder er levedyktige måter å studere celle skjebne in vivo.
Protocol
Representative Results
Discussion
På grunn av teknologiske begrensninger, er det alltid vanskelig å undersøke oppførselen til celler in vivo. Imidlertid blir celle avstamning tracing teknikk vist seg å være et kraftig verktøy for å studere cellebiologi 7-9. I denne studien har vi ytterligere forbedre denne protokollen ved å kombinere den med immunfluorescens. På denne måte kan celle skjebne defineres av flere beslektede markører, som utvider anvendelsen av avstamning sporing. Videre viser denne samlokalisering av immunflu…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
This study was supported by NIH grant DE025014 to JQF.
Materials
| Tamoxifen | Sigma | T5648 | activate the Cre event |
| Paraformaldehyde | Sigma | P6148 | fix the sample |
| Ethylenediaminetetraacetic acid | Alfa Aesar | A10713 | decalcify the hard tissue |
| Sucrose | Sigma | S0389 | dehydrate the tissue |
| Hyaluronidase from bovine testes | Sigma | H4272 | retrieve antigen for immunochemical staining |
| Bovine serum albumin | Sigma | A3059 | blocking solution |
| primary antibody for Runx2 | Cell Signal | D1L7F | primary antibody for immunochemical staining |
| primary antibody for DMP1 | provided by Dr. Chunlin Qin | primary antibody for immunochemical staining | |
| anti-rabbit IgG | Sigma | 18140 | control for immunochemical staining |
| secondary antibody | Invitrogen | A11008 | second antibody for immunochemical staining |
| OCT | Tissue-Tek | 4583 | embed the sample for frozen section |
| Tween 20 | Fisher Scientific | BP337 | PBST |
| non-fluorescing antifade mountant | Life technologies | P36934 | mounting slides |
| DAPI | Life technologies | P36931 | nuclear staining |
| Hydrophobic Barrier Pen | Vector Laboratories | circle the section on the slide for for immunochemical staining | |
| Xylazine | AnaSed | anesthetization | |
| Ketaset | Zoetis | anesthetization | |
| cryosection machine | Leica | CM1860 UV | |
| confocal microscope | Leica | DM6000 CFS |
References
- Gibson, G. Active role of chondrocyte apoptosis in endochondral ossification. Microsc Res Tech. 43 (2), 191-204 (1998).
- Kronenberg, H. M. Developmental regulation of the growth plate. Nature. 423 (6937), 332-336 (2003).
- Shapiro, I. M., Adams, C. S., Freeman, T., Srinivas, V. Fate of the hypertrophic chondrocyte: microenvironmental perspectives on apoptosis and survival in the epiphyseal growth plate. Birth Defects Res C Embryo Today. 75 (4), 330-339 (2005).
- Kahn, A. J., Simmons, D. J. Chondrocyte-to-osteocyte transformation in grafts of perichondrium-free epiphyseal cartilage. Clin Orthop Relat Res. (129), 299-304 (1977).
- Roach, H. I. Trans-differentiation of hypertrophic chondrocytes into cells capable of producing a mineralized bone matrix. Bone Miner. 19 (1), 1-20 (1992).
- Park, J., et al. Dual pathways to endochondral osteoblasts: a novel chondrocyte-derived osteoprogenitor cell identified in hypertrophic cartilage. Biol Open. 4 (5), 608-621 (2015).
- Kretzschmar, K., Watt, F. M. Lineage tracing. Cell. 148 (1-2), 33-35 (2012).
- Humphreys, B. D., DiRocco, D. P. Lineage-tracing methods and the kidney. Kidney Int. 86 (3), 481-488 (2014).
- Romagnani, P., Rinkevich, Y., Dekel, B. The use of lineage tracing to study kidney injury and regeneration. Nat Rev Nephrol. 11 (7), 420-431 (2015).
- Yang, G., et al. Osteogenic fate of hypertrophic chondrocytes. Cell Res. 24 (10), 1266-1269 (2014).
- Yang, L., Tsang, K. Y., Tang, H. C., Chan, D., Cheah, K. S. Hypertrophic chondrocytes can become osteoblasts and osteocytes in endochondral bone formation. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (33), 12097-12102 (2014).
- Jing, Y., et al. Chondrocytes Directly Transform into Bone Cells in Mandibular Condyle Growth. J Dent Res. 94 (12), 1668-1675 (2015).
- Zhou, X., von der Mark, K., Henry, S., Norton, W., Adams, H., de Crombrugghe, B. Chondrocytes transdifferentiate into osteoblasts in endochondral bone during development, postnatal growth and fracture healing in mice. PLoS Genet. 10 (12), (2014).
- Purcell, P., Trainor, P. A. The Mighty Chondrocyte: No Bones about It. J Dent Res. 94 (12), 1625-1627 (2015).
- Gebhard, S., et al. Specific expression of Cre recombinase in hypertrophic cartilage under the control of a BAC-Col10a1 promoter. Matrix Biol. 27 (8), 693-699 (2008).
- Kalajzic, Z., et al. Directing the expression of a green fluorescent protein transgene in differentiated osteoblasts: comparison between rat type I collagen and rat osteocalcin promoters. Bone. 31 (6), 654-660 (2002).
- Akiyama, H., et al. Osteo-chondroprogenitor cells are derived from Sox9 expressing precursors. Proc Natl Acad Sci U S A. 102 (41), 14665-14670 (2005).
- Henry, S. P., et al. Generation of aggrecan-CreERT2 knockin mice for inducible Cre activity in adult cartilage. Genesis. 47 (12), 805-814 (2009).
- Ren, Y., Lin, S., Jing, Y., Dechow, P. C., Feng, J. Q. A novel way to statistically analyze morphologic changes in Dmp1-null osteocytes. Connect Tissue Res. 55, 129-133 (2014).
- Pest, M. A., Beier, F. Developmental biology: Is there such a thing as a cartilage-specific knockout mouse?. Nat Rev Rheumatol. 10 (12), 702-704 (2014).
- Tsang, K. Y., Chan, D., Cheah, K. S. Fate of growth plate hypertrophic chondrocytes: death or lineage extension?. Dev Growth Differ. 57 (2), 179-192 (2015).
- Sugimoto, Y., Takimoto, A., Hiraki, Y., Shukunami, C. Generation and characterization of ScxCre transgenic mice. Genesis. 51 (4), 275-283 (2013).
- Feng, J. Q., et al. Generation of a conditional null allele for Dmp1 in mouse. Genesis. 46 (2), 87-91 (2008).
- Lu, Y., Xie, Y., Zhang, S., Dusevich, V., Bonewald, L. F., Feng, J. Q. DMP1-targeted Cre expression in odontoblasts and osteocytes. J Dent Res. 86 (4), 320-325 (2007).
- Rios, A. C., Fu, N. Y., Lindeman, G. J., Visvader, J. E. In situ identification of bipotent stem cells in the mammary gland. Nature. 506 (7488), 322-327 (2014).
- Blanpain, C., Simons, B. D. Unravelling stem cell dynamics by lineage tracing. Nat Rev Mol Cell Biol. 14 (8), 489-502 (2013).
- Huh, W. J., Khurana, S. S., Geahlen, J. H., Kohli, K., Waller, R. A., Mills, J. C. Tamoxifen induces rapid, reversible atrophy, and metaplasia in mouse stomach. Gastroenterology. 142 (1), 21-24 (2012).
- Lee, M. H., Kim, J. W., Kim, J. H., Kang, K. S., Kong, G., Lee, M. O. Gene expression profiling of murine hepatic steatosis induced by tamoxifen. Toxicol Lett. 199 (3), 416-424 (2010).
- Nakamura, E., Nguyen, M. T., Mackem, S. Kinetics of tamoxifen-regulated Cre activity in mice using a cartilage-specific CreER(T) to assay temporal activity windows along the proximodistal limb skeleton. Dev Dyn. 235 (9), 2603-2612 (2006).
