Nous présentons un modèle de lésion de la moelle épinière à base de déplacement tissulaire qui peut provoquer une lésion de la moelle épinière persistante et cohérente chez les souris adultes.
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Nous présentons un modèle de lésion de la moelle épinière à base de déplacement tissulaire qui peut provoquer une lésion de la moelle épinière persistante et cohérente chez les souris adultes.
La production d'une lésion contusive cohérente et reproductible de la moelle épinière (SCI) est essentielle pour minimiser les variabilité comportementale et histologique entre les animaux expérimentaux. Plusieurs modèles SCI contusifs ont été développés pour produire des blessures en utilisant différents mécanismes. La gravité du SCI repose sur la hauteur d'un poids donné, de la force de blessure ou du déplacement de la moelle épinière. Dans l'étude en cours, nous introduisons un nouveau dispositif SCI contourant la souris, l'impacteur à l'instrument du système de lésion de Louisville (LISA), qui peut créer un SCI à déplacement avec une forte vitesse de blessure et une précision. Ce système utilise des capteurs de distance laser combinés avec un logiciel avancé pour produire des blessures graduées et hautement reproductibles. Nous avons effectué une SCI contusive au 10ème niveau vertébral thoracique (T10) chez la souris pour démontrer la procédure étape par étape. Le modèle peut également être appliqué aux niveaux cervical et lombaire de la colonne vertébrale.
La lésion de la moelle épinière (SCI) la plus fréquente chez les humains est une SCI 1 contusive. Pour étudier les mécanismes de lésions et les différentes stratégies thérapeutiques suivant SCI, un modèle SCI contusif précis, cohérent et reproductible chez les rongeurs est nécessaire.
De nombreux modèles de blessure contusive de la moelle épinière avec divers mécanismes de production de blessures ont été utilisés dans les recherches expérimentales SCI 2 , 3 , 4 , 5 , 6 . Trois modèles SCI contusifs - plus précisément, l'impact de l'Étrémière New York de New York (NYU) / Multicenter Animal Spain Cord Injury Studies (MASCIS) impactor 3 , 6 , l'équipement de l'Impact State / OIC électromagnétique SCI de l'Université de l'Ohio (OSU) (ESCID) 5 , 7 , unD l'Impactor Infinite Horizon (IH) 4 , 8 - sont largement acceptés dans le domaine de recherche SCI. L'impacteur NYU / MASCIS ou un équivalent produit une blessure en laissant tomber un poids fixe de différentes hauteurs sur la moelle épinière cible pour créer de multiples sévérités 3 , 6 . L'OSU / ESCID provoque des blessures en induisant un déplacement de tissu 5 , 7 . L'impacteur IH produit des blessures en appliquant différentes forces à la moelle épinière 4 , 8 . Chaque élément de frappe utilise une vitesse différente, qui est un paramètre important qui influe sur les résultats de blessure. L'appareil NYU / MASCIS génère des vitesses allant de 0,33 à 0,9 m / s. Le dispositif IH a une vitesse maximale de 0,13 m / s 4 . L'élément de frappe OSU / ESCID a une vitesse fixe de 0,148 m / s 5 . Notamment, les vitesses desLes modèles se sont inférieurs à ceux observés dans les vitesses cliniques, qui dépassent habituellement 1,0 m / s 9 .
Ici, nous introduisons un nouveau dispositif SCI contusif basé sur le déplacement, appelé l'appareil du système de lésion de Louisville (LISA), pour produire des SCI chez des souris à forte vitesse d'impact 10 . Ce système comprend un stabilisateur vertébral, qui stabilise fermement la vertèbre au site de la blessure, permettant la production d'un SCI constant et reproductible. Le capteur laser de l'appareil assure la détermination précise du déplacement des tissus et la sévérité résultante du SCI. La vitesse du plongeur au point de contact avec la moelle épinière peut être ajustée de 0,5 à 2 m / s. Ces paramètres de blessure répliquent étroitement les SCI traumatiques cliniquement.
Toutes les procédures chirurgicales et de manipulation des animaux ont été effectuées comme approuvé dans le Guide pour la prise en charge et l'utilisation des animaux de laboratoire (Conseil national de recherches) et les Directives du Comité de soins et de soins pour animaux institutionnels de l'École de médecine de l'Université de l'Indiana.
1. Préparation de l'animal et réalisation de la laminectomie spinale T10
2. Effectuer la blessure par contournement T10 à l'aide de l'Impactor LISA
Ce dispositif se compose de cinq composants principaux: (1) un corps avec une pointe d'impact ( Figure 1C ), (2) un ordinateur avec logiciel ( Figure 1B ), (3) un boîtier de commande électrique ( Figure 1B ), (4) a Stabilisateur vertébral ( figure 2A ), et (5) air comprimé pour le système de commande pneumatique ( figure 1A ). Pour induire un déplacement précis des tissus, le système repose sur un capteur laser pour mesurer la distance entre le plongeur complètement étendu et la surface dorsale ciblée de la moelle épinière. Le logiciel prend en compte l'épaisseur de 4 mm de la pointe en raison du fait que le rayon laser n'atteint la surface réfléchissante de l'élément de frappe ( figure 2B et figure 3A -1 ). Il existe deux positions auxquelles la pointe du piston peut être placée: (1) iN le trajet du faisceau laser ( Figure 3A -1 ) ou (2) dans une position latérale à l'écart du faisceau laser ( Figure 3B -1 ). Lorsque le plongeur est dans le chemin du faisceau laser ( Figure 3A -1 ), il mesure la distance de la pointe de l'impact et surveille la vitesse de la pointe de l'impacteur pendant le mouvement entre l'extension et la rétraction. Lorsque le plongeur est en position latérale à l'écart du trajet du faisceau laser ( Figure 3B -1 ), on mesure la distance entre le laser et la moelle épinière.
La stabilisation de la vertèbre T10 à l'aide de notre stabilisateur vertébral est une composante intégrale de la procédure ( Figure 2A ) 10 , 11 . Des mesures de distance fiables utilisant le capteur laser dépendent de la sCapacité de la cible, qui peut être déformée si le mouvement est présent. Pour déterminer la précision et la cohérence de ce système, 8 souris ont été soumises à des blessures par déplacement de 0,5 mm. Ces animaux ont montré une variabilité de déplacement de ± 0,001 mm (± DE), ce qui indique que le système est très précis et reproductible. La figure 4 démontre la vertèbre cible immobilisée dans le stabilisateur ( Figure 4A ) et la moelle épinière T10 exposée avant ( Figure 4B ) et après contusion ( Figure 4C ) sous un microscope chirurgical.
La pression de l'air comprimé contrôle la vitesse de l'élément de frappe au moment de la blessure. Nos données démontrent que la vitesse d'impact est de 0,81 ± 0,0345 m / s (moyenne ± DE) à une pression de 138 kPa. Le bouton ( Figure 1B ) sur les contrôles de la boîte électriqueLa durée du contact du cordon (temps de séjour) suite à la blessure, et il peut être réglé entre 0 et 5 000 ms. Le temps de maintien du cordon de pointe dans la plupart des expériences est fixé à 0,32 ± 0,0147 s (moyenne ± DE) ( Figure 5 ). À l'aide de cet appareil, des blessures contusives dépendantes de la gravité peuvent être produites avec des déplacements tissulaires de 0 mm (contrôle simulée), 0,2 mm (blessure légère), 0,5 mm (blessure modérée) et 0,8 mm (blessure grave) chez la souris adulte ( figure 6 ).

Figure 1: L'appareil du système de lésions de Louisville (LISA). ( A ) Le système comprend un élément de frappe, un système de contrôle et une source d'air comprimé. ( B ) Le système de contrôle comprend une boîte de commande et un ordinateur portable. Le logiciel et les boutons de commande de la boîte de contrôle permettent à l'utilisateur de créerLish les paramètres de blessure. ( C ) Le capteur laser est le composant clé de l'appareil et mesure la position de la cible de blessure, la distance entre la moelle épinière et le capteur et la vitesse de blessure. Le mouvement rapide et descendant de la pointe d'impact est alimenté par de l'air comprimé. L'emplacement de la blessure et la sévérité du déplacement des tissus sont ajustés par des microdrivers, qui contrôlent le mouvement en trois dimensions. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 2: Le stabilisateur et le support de la souris. ( A ) Le stabilisateur de la colonne vertébrale se compose d'un creux en forme de U et de deux bras métalliques pour maintenir la vertèbre de la souris. ( B ) Le stabilisateur est ensuite monté sur le dispositif de frappe. TLa ligne rouge indique le chemin du faisceau laser. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 3: méthode pour produire une SCI contusante. ( A - C ) Le logiciel de l'interface utilisateur graphique (GUI) avec trois paramètres / zones de blessure est affiché. ( A , A-1 ) La zone verte (SET ZERO LEVEL) étalonne la distance de la pointe du piston. La ligne rouge indique le chemin du faisceau laser. ( B , B-1 ) La zone bleue sert à régler le niveau de blessure (SET NUITE DE BLESSURE). L'élément de frappe est soulevé et déplacé latéralement sur le côté droit pour permettre au faisceau laser d'atteindre la surface dorsale de la moelle épinière pour régler le niveau zéro. La ligne rouge indique le laser b Eam Path. ( C , C-1 ) Avant l'impact, la pointe est déplacée sur le chemin du faisceau laser pour exécuter la blessure (RUN). Les paramètres de blessure sont dans la zone rouge (RUN EXPERIMENT). La ligne rouge indique le chemin du faisceau laser. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 4: Exposition et évaluation des blessures. ( A ) Les bras métalliques du stabilisateur de la colonne vertébrale stabilisent la vertèbre T10. ( B ) laminectomie T10 pour exposer la moelle épinière, avec les vaisseaux dorsaux clairement vus. ( C ) La contusion induite par l'impact (flèche) sur la surface dorsale de la moelle épinière confirme la blessure. Barre d'échelle = 2 mm.G4large.jpg "target =" _ blank "> Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 5: Paramètres de blessure. Les paramètres de blessure constants comprennent le déplacement des tissus (mm), la vitesse de blessure (m / s) et le (s) moment (s) d'arrêt de la pointe. N = 8, moyenne ± SD. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.

Figure 6: Évaluation histologique. Les sections représentatives de la moelle épinière, colorées avec Cresyl Violet et Eosin, montrent des blessures dépendantes de la sévérité après ( A ) simulée (0 mm), ( B ) doux (0,2 mm), ( C D ) sévères (0,8 mm) à T10 à l'aide du dispositif LISA. Les images ont été prises lors de l'épicentre des blessures. Barre d'échelle = 500 μm. Cliquez ici pour voir une version plus grande de ce chiffre.
En 1911, Allen a décrit le premier modèle de perte de poids en utilisant un poids fixe pour induire des blessures sur les cordes épinaires exposées aux chiens 12 . Des modèles de perte de poids similaires ont été développés en fonction du modèle Allen, y compris l'élément de frappe NYU / MASCIS 3 , 6 , 13 , 14 . En plus du modèle de perte de poids, d'autres dispositifs SCI ont été créés. Le modèle OSU / ESCID 5 , 7 utilise un mécanisme de déplacement des tissus pour contrôler la gravité des blessures, et le modèle IH 4 , 8 utilise la force pour créer un SCI graduable. Dans ces systèmes, la stabilisation vertébrale est obtenue en serrant les processus épineux rostral et caudal au site de blessure. Ces appareils utilisent des vitesses de blessure faibles, en particulier 0,33 à 0,9 m / s (NYU / MASCIS), 0,148 m / s (OSU / ESCID)Et 0,13 m / s (IH). La stabilisation des processus épineux rostral et caudal peut provoquer une flexibilité de la colonne vertébrale et un mouvement de la colonne vertébrale pendant l'impact, ce qui peut affecter la précision des blessures.
La méthode LISA tente de surmonter les faiblesses des modèles existants, en particulier en ce qui concerne l'instabilité de la colonne vertébrale et une faible vitesse de blessure. Cette méthode utilise la stabilisation bilatérale des facettes et évite les artefacts de mouvement associés à la blessure. Ce dispositif utilise une vitesse d'impact élevée qui peut être réglée entre 0,5-2 m / s 11 , 15 . Le capteur laser est plus avancé que le Vibreur Ling utilisé dans le modèle ESCID et mesure précisément la distance de la surface de la moelle épinière sans nécessiter aucun contact tissulaire. Le modèle a été développé à l'origine pour produire un rat SCI, et il a maintenant été adapté pour produire SCI sur les souris et sur les primates non humains 16 , avec des modifications.
Spine stL'abilisation réduit la variabilité de toutes les méthodes SCI expérimentales, en particulier dans les modèles de déplacement tissulaire. Le capteur de distance laser détermine l'ampleur du déplacement tissulaire de la moelle épinière pendant les mouvements respiratoires. Il est important que le point de la moelle épinière sur lequel le laser soit focalisé soit le point identique frappé par l'élément de frappe. Cette étape s'effectue pendant l'étape d'étalonnage ( Figure 3 ), lorsque la pointe de l'impact et le faisceau laser sont alignés. Une faiblesse potentielle de ce modèle est que l'ampleur du déplacement des tissus est mesurée à partir de la surface dural. Bien que l'épaisseur de la dure dure constitue une différence négligeable entre les animaux, une variabilité significative peut exister dans l'espace sous-arachnoïdien rempli de liquide céphalo-rachidien (LCR). La variabilité dans les résultats de blessure peut se produire lors de la production d'une blessure à contusion très légère en utilisant un petit déplacement de tissu. Dans l'ensemble, la cohérence de la blessure dépend principalementSur la précision du déplacement des tissus et aussi sur la vitesse et le temps de contact des tissus du plongeur.
La gamme de déplacement des tissus est large (précision: 0-10 ± 0.005 mm). Sur la base de données pilotes antérieures et d'informations publiées dans les rongeurs et les primates non humains, un déplacement de 20% du diamètre antéro-postérieur du SC produit un SCI doux, un déplacement de 30 à 40% produit un SCI modéré et un déplacement de> 50% Produit des SCI sévères à une vitesse de 1 m / s. Il y aura de légères différences selon les espèces animales. Le temps de séjour est réglable de 0 à 5 s en utilisant un relais temporel. Dans notre étude, le temps de séjour a été fixé à 300 ms. Cela peut être facilement ajusté pour reproduire les temps de fonctionnement d'autres périphériques SCI, y compris les modèles NYU et IH.
En résumé, nous avons développé un modèle de SCI contusif à base de déplacement chez la souris adulte. Le modèle utilise un stabilisateur en U pour stabiliser les facettes bilatérales de la colonne vertébrale, en évitant le cordonObjets de mouvement associés à la mesure guidée par laser de la surface du cordon. Ce modèle peut produire des lésions de cordon à grande vitesse de 0,5 à 2 m / s. Le capteur laser est plus précis que la méthode conventionnelle pour déterminer la vitesse et la distance à la surface d'impact. Le modèle peut provoquer des lésions de la moelle épinière à tous les niveaux, de légère à sévère. Lorsqu'il est modifié, cet appareil peut également produire des blessures chez les rats et les grands animaux, comme les primates non humains.
Christopher B. Shields, MD est propriétaire du système Louisville Injury System Apparatus (LISA) produit par Louisville Impactor System, LLC.
Ce travail a été soutenu en partie par NIH NS059622, NS073636, DOD CDMRP W81XWH-12-1-0562; Prix de révision du mérite I01 BX002356 du US Department of Veterans Affairs; Craig H Neilsen Foundation 296749; Fondation de recherche sur les lésions cérébrales de l'Indiana et Fonds de dotation Mari Hulman George (XMX); Norton Healthcare, Louisville, KY (YPZ); L'État de l'Indiana ISDH 13679 (XW); Et la Fondation NeuroCures.
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| Kétamine (7,2 mg/mL)/Xylazine (0,475 mg/mL)/Acépromazine | Patterson Veterinary | 07-890-8598/07-869-7632/07-808-1947 | Agent anesthésique |
| Buprénorphine (0,03 mg/mL) | Patterson Veterinary | 07-891-9756 | Agent analgésique |
| Carprofène | Patterson Veterinary | 07-844-7425 | agent antibiotique |
| Purdue Products Betadine Surgerical scrub | Fisher Scientific | 19-027132 | pour la stérilisation de la peau |
| Éponges de gaze Dukal | Fisher Scientific | 22-415-490 | pour la stérilisation de la peau |
| Decon Ethanol 200 Proof | Fisher Scientific | 04-355-450 | pour la stérilisation de la peau |
| 1 mL NORM-JECT | HENKE SASS WOLF | D-78532 | pour l’anesthésie/soulagement de la douleur/injection d’agent antibiotique |
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| LISA | Louisville Impactor System | N/A | Produire une contusion expérimentale de la moelle épinière chez la souris |