Studerer mitokondrie struktur og funksjon i<em> Drosophila</em> Eggstokkene
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Mitokondrier er klassisk beskrevet som den cellulære drivkraft, siden de er de viktigste seter av energiproduksjonen i differensierte celler. Videre mitokondrier spille en avgjørende rolle i metabolismen, varmeutvikling, lipid modifikasjon, kalsium og redoks-homeostase, leiing av cellesignaleringsprosesser, etc. 1. Mitokondrier også spille en aktiv rolle i induksjonen av celledød 2, så vel som i cellesyklusregulering 3. Slike multifunksjonalitet hever følgende grunnleggende spørsmål: a) hvordan mitokondrier utføre alle disse funksjonene samtidig, og b) er det spesifikke mitokondrielle bassenger eller undersoner som er spesialisert for ulike funksjoner? I denne sammenheng er det viktig å merke seg at de multifunksjonelle mitokondriene er dynamisk i sin form, størrelse og struktur innenfor individuelle celler, og at steady-state form av mitokondriene kan variere mellom celletyper. Tiår med forskning fra ulike laboratorier tyder på at endring av mitokondrie form, størrelse og struktur, kollektivt kalt mitokondrielle dynamikk, er avgjørende for å opprettholde ulike mitokondrielle funksjoner 4,5,6. Disse funnene øke muligheten for at mitokondriene kan utføre sin multifunksjonalitet i kraft av deres strukturelle dynamikk.
Omfattende tiltak er underveis for å forstå mitokondrie struktur-funksjon forholdet. Dynamikken i mitokondriestruktur er primært vedlikeholdt av deres evne til å gjennomgå fisjon og fusjon hendelser med hverandre. Fisjon av store mitokondrier konverterer dem i mindre mitokondrielle elementer, mens fusjon mellom to mindre mitokondriene fusjonerer dem inn i en større mitokondrie element 7. Videre kan forbigående fusjon av to mitokondrier forekomme for å tillate blanding av innholdet. De fisjon og fusjon hendelsene i de indre og ytre mitokondrielle membraner er nøye regulert av specific sett av proteiner. Kjernen fisjon maskiner består av dynamin relaterte protein 1 (Drp1), som er rekruttert fra cytosol til mitokondriene ved sin interaksjon med visse bona fide mitokondrielle proteiner (f.eks Fis1 eller Mff1), mens Drp1 funksjonen kan også være regulert av andre proteiner på overflaten mitokondrielle 4. Selv om Drp1 opererer på den ytre membran, dets fisjons egenskaper påvirke den indre membran i tillegg. Leiing av fisjon av ytre og indre mitokondrielle membraner er ikke godt forstått. På den annen side er fusjon av den indre membran styrt i kjernen av aktivitetene til Opa1, mens mitofusins styrer sammensmelting av den ytre-membran 5. Balansen av motvirkende fisjon og fusjon hendelsene i mitokondriene diktere steady-state mitokondrie form i en celle. For eksempel vil undertrykkelse av mitokondriell spalting resulterer i fullstendig og uten motstand fusjon, mens den over-aktivitet av mitokondrierl fisjon vil resultere i fragmentering av mitokondrier tre.
Studiet av mitokondrie struktur-funksjon forholdet innebærer først og fremst to gratis tilnærminger: a) analyser av de cellulære og organisme fenotyper etter genetisk manipulering av mitokondrie fisjon / fusjonsproteiner og b) direkte vurdering av mitokondrie struktur og funksjon. Det er bemerkelsesverdig at genetiske analyser ikke alltid avsløre den direkte funksjon av molekylet for hånden (i dette tilfellet, mitokondrielle fisjon / fusjonsproteiner), som fenotypene kan oppstå på grunn av sekundære effekter. Derfor er det av største betydning for å utvikle og bruke verktøy for å studere mitokondrie struktur og funksjon direkte. Enhver vurdering av mitokondriestruktur innebærer ulike mikroskopi verktøy. Bruk av fluorescens mikroskopi av levende celler har i stor grad avanserte studier av mitokondrie dynamikk, siden mitokondrie dynamikk kan overvåkes både kvalitativt og Quantitätively bruke de riktige fluorescens mikroskopi verktøy og teknikker 8. Fluorescens mikroskopi-basert verktøy har blitt utviklet for å studere mitokondrie struktur og funksjon i levende og faste Drosophila melanogaster vev, belyse betydningen av mitokondrie dynamikk in vivo 9. Disse og beslektede metoder er beskrevet her, med mål om å studere mitokondrie struktur og funksjon i Drosophila eggstokk.
Drosophila eggstokk består av germline og somatiske slektsnavn, som oppstår fra sine respektive voksne stamceller som bor i germarium 10,11. Seksten syncytial kjønnsceller (GCS) blir innkapslet av somatiske hårsekkceller (FCS) for å danne individuelle egg kamre som fremkommer ut fra den germarium (figur 1). En av de 16 GCer blir forpliktet seg til å bli en oocytt, og de resterende 15 GCer utvikle seg til sykepleier celler som understøtter veksten av eggcelle kammeret, Lette modning av egget før den legges. Flertallet av FCS gjennomgå 9 runder med mitotiske divisjoner før de kommer ut av mitotiske cellesyklus til terminalt differensiere i en mønstret epitelcellelaget bestående av fremre hårsekkceller (AFCS), posterior hårsekkceller (PFK), og hoved kroppens celler (MBCS) . De etterfølgende egg kamrene er forbundet med stilken celler, som differensierte celler som også er utledet fra FCS tidlig i utviklingen. Mitokondrie form regulert av mitokondrie fisjon protein Drp1 er aktivt involvert i prosessen med differensiering under normal utvikling av Drosophila eggstokkreft FC lag 9,12. Metodene som anvendes i disse studier for å identifisere involvering av Drp1 i Drosophila follikkel cellelaget utvikling er beskrevet her.
Protocol
Representative Results
Discussion
Kritiske trinn i protokollen
Photobleaching: Forebygge unødig fotobleking av fluorescerende prøver er helt nødvendig for å utføre effektiv konfokalmikroskopi. Derfor bør tiden brukes til å finne eksempler gjennom okularet eller å sette bildeinnhentingsparametere via live skannemodus minimeres for å minimere photobleaching.
Vevsskade: Siden mitokondriene er ansett for å være sensorene av cellular helse, er det svært viktig å si…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
