Estudar mitocondrial estrutura e função em<em> Drosophila</em> ovários
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
As mitocôndrias são classicamente descritos como a potência celular, uma vez que eles são os principais lugares de produção de energia em células diferenciadas. Além disso, as mitocôndrias desempenham um papel crítico no metabolismo, a geração de calor, a modificação lipídica, o cálcio e homeostase redox, a orquestração de processos de sinalização de células, etc 1. As mitocôndrias desempenham também um papel activo na indução de morte celular 2, bem como na regulação do ciclo celular 3. Essa multifuncionalidade levanta as seguintes questões fundamentais: a) como mitocôndrias desempenhar todas estas funções em simultâneo e b) existem piscinas mitocondriais específicos ou subzonas que são especializados para funções distintas? Neste contexto, é importante notar que as mitocôndrias são multifuncionais dinâmica na sua forma, tamanho e estrutura dentro das células individuais e que a forma de estado estacionário de mitocôndrias pode variar entre os tipos de células. Décadas de pesquisa de vários laboratóriooratórios sugerem que a alteração da forma mitocondrial, tamanho e estrutura, chamados coletivamente de dinâmica mitocondrial, é crucial para a manutenção de várias funções mitocondriais 4,5,6. Estes resultados levantam a possibilidade de que mitocôndrias podem cumprir a sua multi-funcionalidade em virtude do seu dinamismo estrutural.
grandes esforços estão em curso para entender a relação estrutura-função mitocondrial. A dinâmica da estrutura mitocondrial é mantida principalmente pela sua capacidade de sofrer eventos de fissão e de fusão com o outro. Fissão de grandes mitocôndrias converte-os em elementos mitocondriais menores, enquanto a fusão entre duas mitocôndrias menores funde-os em um elemento mitocondrial maior 7. Além disso, a fusão de duas mitocôndrias transiente pode ocorrer para permitir a mistura do seu conteúdo. Os eventos de fissão e de fusão das membranas mitocondriais interior e exterior são cuidadosamente regulada pela especificaçãoific conjuntos de proteínas. A maquinaria do núcleo fissão é composto de proteína relacionada com dinamina 1 (Drp1), que é recrutados a partir do citosol para a mitocôndria pela sua interacção com certos bona proteínas mitocondriais fide (por exemplo, Fis1 ou Mff1), enquanto função Drp1 também pode ser regulado por outras proteínas na superfície mitocondrial 4. Embora Drp1 opera na membrana externa, as suas capacidades de fissão impacto da membrana interior assim. A orquestração da cisão das membranas mitocondriais exteriores e interiores não é bem compreendido. Por outro lado, a fusão da membrana interna é regulada no núcleo pelas actividades de OPA1, enquanto mitofusins governar a fusão da membrana externa 5. O saldo das contrariando fissão e fusão eventos de mitocôndrias ditar a forma mitocondrial steady-state em uma célula. Por exemplo, a repressão da fissão mitocondrial resultaria em fusão completa e sem oposição, enquanto que a sobre-actividade das mitocôndriasl fissão resultaria em fragmentação da mitocôndria 3.
O estudo da relação estrutura-função mitocondrial envolve principalmente duas abordagens complementares: a) análise dos fenótipos celulares e organismais após a manipulação genética de proteínas fissão / fusão mitocondrial e b) as avaliações diretas de estrutura e função mitocondrial. É digno de nota que as análises genéticas podem nem sempre revelar a funcionalidade directa da molécula no lado (neste caso, as proteínas de fissão / fusão mitocondriais), como os fenótipos podem surgir devido a efeitos secundários. Portanto, é de extrema importância para desenvolver e usar ferramentas para estudar a estrutura e função mitocondrial diretamente. Qualquer avaliação da estrutura mitocondrial envolve várias ferramentas de microscopia. Uso de microscopia de fluorescência de células vivas tem avançado muito nos estudos de dinâmica mitocondrial, uma vez que o dinamismo mitocondrial pode ser monitorado de forma qualitativa e Quantitätvamente utilizando as ferramentas e técnicas apropriadas 8 de microscopia de fluorescência. Ferramentas com base em microscopia de fluorescência foram desenvolvidos para estudar a estrutura e a função mitocondrial em tecidos vivos e fixos de Drosophila melanogaster, elucidar a importância de dinamismo mitocondrial in vivo 9. Estes e os métodos relacionados são descritos aqui, com o objectivo de estudar a estrutura e a função mitocondrial no ovário de Drosophila.
O ovário Drosophila consiste em germinativas e somáticas linhagens, que surgem a partir de suas respectivas células-tronco adultas que residem no germário 10,11. Dezesseis células germinativas sincicial (GCs) se encapsulado por células do folículo somáticas (FCS) para formar câmaras de ovos individuais que emergem fora do germário (Figura 1). Um dos 16 GCs se comprometeu a tornar-se um oócito, e os restantes 15 GCs desenvolvem em células enfermeira que suportam o crescimento da câmara de oócito, Facilitando a maturação do ovo, antes de ser colocado. A maioria dos CFs submetidos a 9 ciclos de divisões mitóticas antes de sair do ciclo celular mitótico para diferenciar terminalmente em uma camada de células epiteliais modelado que consiste de células anterior dos folículos (AFCs), células foliculares posterior (PFC), e as células do corpo principal (CBMs) . As câmaras de ovo consecutivos são ligados por células haste, que são células que são também derivados das CFs no início do desenvolvimento diferenciadas. Forma mitocondrial regulado pelo Drp1 proteína fissão mitocondrial está ativamente envolvido no processo de diferenciação durante o desenvolvimento normal da camada FC ovário Drosophila 9,12. Os métodos utilizados nestes estudos para identificar o envolvimento de Drp1 em Drosophila desenvolvimento da camada de células do folículo são descritos aqui.
Protocol
Representative Results
Discussion
Passos críticos dentro do Protocolo
Fotodegradação: Prevenção de fotodegradação indevida de amostras fluorescentes é absolutamente necessário para a realização de microscopia confocal eficiente. Portanto, o tempo usado para localizar amostras através da ocular ou para definir os parâmetros de aquisição de imagem através do modo de varredura ao vivo deve ser minimizado para minimizar a fotodegradação.
O dano tecidual: Uma …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
