Изучение Митохондриальная Структура и функции в<em> Drosophila</em> Яичники
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Митохондрии классически описывается как клеточном электростанцией, так как они являются основными мест производства энергии в дифференцированных клетках. Кроме того, митохондрии играют критическую роль в обмене веществ, выработки тепла, липидного модификации, кальция и окислительно – восстановительного гомеостаза, оркестровка клеточных процессов передачи сигналов, и т.д. 1. Митохондрии также играют активную роль в индукции клеточной смерти 2, а также в регуляции клеточного цикла 3. Такая многофункциональность поднимает следующие основные вопросы: а) как митохондрии выполняют все эти функции одновременно и б) существуют специфические митохондриальные бассейны или подзоны, которые являются специализированными для различных функций? В этом контексте важно отметить, что многофункциональный митохондрии динамичны в их форме, размеру и структуре в пределах отдельных клеток, и что установившийся форма митохондрий может варьировать между типами клеток. Десятилетия исследований из различных лабораторныхоратории предположить , что изменение митохондриальной формы, размера и структуры, в совокупности называемых митохондриальных динамики, имеет решающее значение для поддержания различных митохондриальных функций 4,5,6. Эти данные указывают на возможность того, что митохондрии могут выполнить свою многофункциональность в силу своей структурной динамики.
Обширные предпринимаются усилия, чтобы понять структурно-функциональные отношения митохондриальную. Динамизм митохондриальной структуры, прежде всего, поддерживается их способность делению и слитые события друг с другом. Деление больших митохондрий превращает их в более мелкие митохондриальных элементов, в то время как слияние между двумя меньшими митохондриях сливает их в больший митохондриальной элемент 7. Кроме того, переходный процесс слияния двух митохондрий может произойти, чтобы позволить смешивание их содержимого. Деление и слитые события внутренней и внешней мембраны митохондрий тщательно регулируются спецификацииIFIC наборы белков. Механизм ядра деления состоит из динамин связанных с белком 1 (drp1), который набраны из цитоплазмы в митохондрии путем его взаимодействия с определенными добросовестные митохондриальных белков (например, Fis1 или Mff1), в то время как функция drp1 также может регулироваться другие белки на поверхности митохондриальной 4. Хотя drp1 работает на внешней мембране, его возможности деления влияют на внутреннюю мембрану, а также. Оркестровка деления наружных и внутренних мембран митохондрий не очень хорошо понял. С другой стороны, слияние внутренней мембраны регулируется в активную зону деятельности OPA1, в то время как mitofusins регулируют слияние наружной мембраны 5. Баланс противодействующих деления и слияния событий митохондрий диктуют стационарную митохондриальную форму в клетке. Например, подавление митохондриального деления приведет к полной и беспрепятственной слияния, в то время как чрезмерной активности митохондрийл деление приведет к фрагментации митохондрий 3.
Изучение структурно-функциональных отношений митохондриальной главным образом состоит из двух взаимодополняющих подходов: а) анализ клеточных и организменном фенотипов после генетической манипуляции митохондриальных деления / слитых белков и б) прямые оценки митохондриальной структуры и функции. Следует отметить, что генетические анализы не всегда могут выявить прямую функциональность молекулы в стороны (в данном случае, митохондриальные деления / слитых белков), как фенотипы могут возникать из-за вторичных эффектов. Поэтому крайне важно развивать и использовать инструменты для изучения митохондриальной структуры и функции непосредственно. Любая оценка митохондриальной структуры включает в себя различные инструменты микроскопии. Использование флуоресцентной микроскопии живых клеток значительно продвинулся вперед исследования митохондриальных динамики, так как митохондриальная динамизм можно контролировать как качественно, так и quantitatраторов , используя соответствующие инструменты и методы 8 флуоресцентной микроскопии. Флуоресцентные инструменты микроскопии на основе были разработаны для изучения митохондриальной структуры и функции в живых и фиксированных тканей MELANOGASTER дрозофилы, выяснении значение митохондриального динамизм в естественных условиях 9. Эти и другие методы описаны здесь, с целью изучения митохондриальной структуры и функции в яичниках дрозофилы.
Яичник Drosophila состоит из зародышевых и соматических родах, которые вытекают из их соответствующих взрослых стволовых клеток , которые находятся в гермарии 10,11. Шестнадцать синцитиальный зародышевые клетки (GCS) получают инкапсулированные соматическими клетками фолликула (FCS) с образованием отдельных яйцевых камер , которые возникают из гермарии (рисунок 1). Один из 16-ти ШС получить стремится стать ооцитов, а остальные 15 ШС перерасти в трофоцитов, которые поддерживают рост ооцитов камеры, Способствуя созреванию яйцеклетки до ее укладки. Большинство ЯК претерпевают 9 раундов митотических делений прежде, чем они выходят из митотического клеточного цикла, чтобы неизлечимо дифференцироваться в узорной эпителиального клеточного слоя, состоящего из переднего фолликулярных клеток (AFCS), задней фолликул клеток (ПФУ), а также основных клеток тела (MBCS) , Последовательные камеры яичные соединены стебле клетками, которые дифференцируются клетки, которые также полученные из ЯК на ранних стадиях развития. Митохондриальная форма регулируется митохондриального белка деления drp1 активно участвует в процессе дифференциации в ходе нормального развития Drosophila яичников FC слоя 9,12. Методы , используемые в этих исследованиях для определения участия drp1 в развитии фолликул клеточного слоя Drosophila описаны здесь.
Protocol
Representative Results
Discussion
Критические шаги в рамках Протокола
Фотообесцвечивания: Предотвращение чрезмерного фотообесцвечивания флуоресцентных образцов является абсолютно необходимым для выполнения эффективной конфокальной микроскопии. Таким образом, время, используемое…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
