Estudiar mitocondrial Estructura y función en<em> Drosophila</em> Los ovarios
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Las mitocondrias se describen clásicamente como el centro energético celular, ya que son los principales asientos de la producción de energía en las células diferenciadas. Por otra parte, las mitocondrias desempeñan un papel crítico en el metabolismo, la generación de calor, la modificación de los lípidos, calcio y homeostasis redox, la orquestación de los procesos de señalización celular, etc 1. Las mitocondrias juegan también un papel activo en la inducción de muerte celular 2, así como en la regulación del ciclo celular 3. Tal multifuncionalidad plantea las siguientes cuestiones fundamentales: a) ¿cómo mitocondrias realizan todas estas funciones simultáneamente y b) hay piscinas mitocondriales específicos o subzonas que están especializados para funciones distintas? En este contexto, es importante observar que las mitocondrias multifuncionales son dinámicas en su forma, tamaño, y la estructura dentro de las células individuales y que la forma de estado estacionario de las mitocondrias pueden variar entre los tipos de células. Décadas de investigación de diversos laboratoriosoratorios sugieren que la alteración de la forma mitocondrial, tamaño y estructura, colectivamente llamados dinámica mitocondrial, es crucial para el mantenimiento de varias funciones mitocondriales 4,5,6. Estos resultados plantean la posibilidad de que las mitocondrias pueden cumplir con su multifuncionalidad en virtud de su dinamismo estructural.
Extensas se están realizando esfuerzos para comprender la relación estructura-función mitocondrial. El dinamismo de la estructura mitocondrial se mantiene principalmente por su capacidad para someterse a eventos de fisión y de fusión entre sí. La fisión de grandes mitocondrias los convierte en elementos mitocondriales más pequeños, mientras que la fusión entre dos pequeñas mitocondrias y los integra en un elemento más grande mitocondrial 7. Por otra parte, la fusión transitoria de dos mitocondria puede ocurrir para permitir la mezcla de su contenido. Los sucesos de fisión y la fusión de las membranas mitocondriales interna y externa son cuidadosamente rigen por specIFIC conjuntos de proteínas. La maquinaria núcleo de fisión se compone de la proteína relacionada con dynamin-1 (Drp1), que se reclutó desde el citosol a las mitocondrias por su interacción con cierto bona proteínas mitocondriales fide (por ejemplo, fis1 o Mff1), mientras que la función Drp1 también puede ser regulada por otras proteínas en la superficie mitocondrial 4. Aunque Drp1 opera en la membrana externa, sus capacidades de fisión impacto de la membrana interna, así. La orquestación de la fisión de las membranas mitocondriales externas e internas no se entiende bien. Por otra parte, la fusión de la membrana interna se rige en el núcleo por las actividades de OPA1, mientras mitofusins gobiernan la fusión de la membrana externa 5. El resto de los eventos que contrarrestan de fisión y de fusión de mitocondrias dictan la forma mitocondrial de estado estable en una célula. Por ejemplo, la represión de la fisión mitocondrial daría lugar a una fusión completa y sin oposición, mientras que el exceso de actividad de las mitocondriasl fisión daría lugar a la fragmentación de las mitocondrias 3.
El estudio de la relación estructura-función mitocondrial implica principalmente dos enfoques complementarios: a) análisis de los fenotipos celulares de Organismos y después de la manipulación genética de las proteínas de la fisión / fusión mitocondrial y b) las evaluaciones directas de la estructura y la función mitocondrial. Es digno de mención que los análisis genéticos no siempre pueden revelar la funcionalidad directa de la molécula en cuestión (en este caso, las proteínas de fisión / fusión mitocondrial), como pueden surgir los fenotipos debido a los efectos secundarios. Por lo tanto, es de suma importancia para el desarrollo y el uso de herramientas para estudiar la estructura y la función mitocondrial directamente. Cualquier evaluación de la estructura mitocondrial implica varias herramientas de microscopía. El uso de microscopía de fluorescencia de células vivas ha avanzado mucho los estudios de dinámica mitocondrial, ya que el dinamismo mitocondrial se puede monitorizar tanto cualitativa como cuantitatIVELY utilizando las herramientas y técnicas de microscopía de fluorescencia 8 apropiadas. Herramientas basadas en la microscopía de fluorescencia se han desarrollado para estudiar la estructura y la función mitocondrial en los tejidos vivos melanogaster y Drosophila fijos, elucidar la importancia de dinamismo mitocondrial in vivo 9. Estos y métodos relacionados se describen aquí, con el objetivo de estudiar la estructura y la función mitocondrial en el ovario Drosophila.
El ovario de Drosophila consiste en la línea germinal y somática linajes, que surgen de sus respectivas células madre adultas que residen en el germarium 10,11. Dieciséis células germinales sincitial (GCS) quedan encapsulados por las células del folículo somáticas (FCS) para formar cámaras de huevos individuales que emergen de la germarium (Figura 1). Uno de los 16 GC se confirmen a convertirse en un ovocito, y los restantes 15 GC se desarrollan en células enfermeras que apoyan el crecimiento de la cámara de ovocitos, Facilitando la maduración del huevo antes de que sea puesto a nadie. La mayoría de las FCs se someten a 9 rondas de divisiones mitóticas antes de que salgan del ciclo celular mitótico para diferenciar terminales en una capa de células epiteliales modelado que consiste en células anterior del folículo (AFCS), las células del folículo posterior (PFC), y las células del cuerpo principal (MBC) . Las cámaras de huevos consecutivos están conectados por las células tallo, que son las células que también se derivan de los bloques FC temprano en el desarrollo diferenciados. Mitocondrial forma regulada por la proteína mitocondrial Drp1 fisión participa activamente en el proceso de diferenciación durante el desarrollo normal de la capa de FC ovario de Drosophila 9,12. Aquí se describen los métodos usados en estos estudios para identificar la participación de Drp1 en el desarrollo de la capa de células del folículo Drosophila.
Protocol
Representative Results
Discussion
Los pasos críticos dentro del Protocolo
Photobleaching: Prevención de photobleaching indebida de muestras fluorescentes es absolutamente necesario para la realización de la microscopía confocal eficiente. Por lo tanto, el tiempo utilizado para localizar muestras a través del ocular o para establecer los parámetros de adquisición de imágenes a través del modo de escaneado directo debe reducirse al mínimo para reducir al mínimo photobleaching.
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The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
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