Mitokondriyal Yapısı ve İşlevi incelenmesi<em> Drosophila</em> Yumurtalıklar
Summary
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Specific methods for studying mitochondrial structure and function in live and fixed Drosophila ovaries are described and demonstrated in this paper.
Abstract
Analysis of the mitochondrial structure-function relationship is required for a thorough understanding of the regulatory mechanisms of mitochondrial functionality. Fluorescence microscopy is an indispensable tool for the direct assessment of mitochondrial structure and function in live cells and for studying the mitochondrial structure-function relationship, which is primarily modulated by the molecules governing fission and fusion events between mitochondria. This paper describes and demonstrates specific methods for studying mitochondrial structure and function in live as well as in fixed tissue in the model organism Drosophila melanogaster. The tissue of choice here is the Drosophila ovary, which can be isolated and made amenable for ex vivo live confocal microscopy. Furthermore, the paper describes how to genetically manipulate the mitochondrial fission protein, Drp1, in Drosophila ovaries to study the involvement of Drp1-driven mitochondrial fission in modulating the mitochondrial structure-function relationship. The broad use of such methods is demonstrated in already-published as well as in novel data. The described methods can be further extended towards understanding the direct impact of nutrients and/or growth factors on the mitochondrial properties ex vivo. Given that mitochondrial dysregulation underlies the etiology of various diseases, the described innovative methods developed in a genetically tractable model organism, Drosophila, are anticipated to contribute significantly to the understanding of the mechanistic details of the mitochondrial structure-function relationship and to the development of mitochondria-directed therapeutic strategies.
Introduction
Onlar farklılaşmış hücrelerin enerji üretiminin ana koltuklar beri Mitokondri klasik, hücresel güç merkezi olarak tarif edilmektedir. Ayrıca, mitokondri metabolizma, ısı üretimi, lipit modifikasyonu, kalsiyum ve redoks homeostazı kritik bir rol, hücre sinyal süreçlerinin orkestrasyon, vb 1 oynarlar. Mitokondri aktif bir hücre ölümü 2 indüklenmesinde rolü hem de hücre döngüsünün düzenlenmesi 3 görüntülemektedir. Böyle çok işlevsellik şu temel soruları gündeme getiriyor: a) nasıl mitokondri aynı anda tüm bu işlevleri yerine ve farklı fonksiyonlar için özel olan belirli mitokondriyal havuzları veya alt bölgeler b) vardır mı? Bu bağlamda, çok fonksiyonlu mitokondri tek tek hücrelerin içindeki şekil, boyut ve yapıda dinamik olduğu ve mitokondri kararlı durum şekil hücre tipleri arasında değişebilir dikkat etmek önemlidir. Çeşitli laboratuvardan yıllarca araştırmaOratories mitokondriyal şekil, boyut, yapı ve toplu olarak adlandırılan mitokondriyal dinamiklerin değiştirilmesi, çeşitli mitokondriyal fonksiyonları 4,5,6 muhafaza etmek için çok önemli olduğunu düşündürmektedir. Bu bulgular, mitokondrinin kendi yapısal dinamizm sayesinde onların çok işlevi yerine getirmek ihtimalini yükseltmek.
Kapsamlı çalışmalar mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisini anlamak için çalışmalar devam etmektedir. mitokondriyal yapının hareketlilik esas olarak birbirleri ile füzyon füzyon olayları geçmesi kabiliyetleri ile muhafaza edilmektedir. Iki küçük mitokondri arasındaki füzyon daha büyük bir mitokondriyal eleman 7 içine birleştirir ise büyük mitokondri Bölünme, küçük mitokondriyal elemanları dönüştürür. Ayrıca, iki mitokondri geçici füzyon içerikleri karışmasını sağlamak için oluşabilir. İç ve dış mitokondriyal membran fizyon ve füzyon olayları dikkatle spec tarafından yönetilirIFIC proteinlerinin ayarlar. Çekirdek fisyon makine Drp1 türünü de kontrol edilebilir olsa da, belirli niyetli mitokondriyal protein (ör Fis1 ya Mff1) ile etkileşim yoluyla mitokondri sitoplazmada katılım olur Dynamin ilişkili protein 1 (Drp1) oluşmaktadır mitokondriyal yüzeyi 4 üzerine diğer proteinler bulunmaktadır. Drp1 dış membran üzerinde çalışmasına rağmen, onun fizyon yetenekleri yanı sıra iç zarı etkiler. dış ve iç mitokondriyal membran fisyon düzenleme tam olarak anlaşılamamıştır. Mitofusins dış zar 5 füzyon yöneten Diğer taraftan, iç membran füzyon, OPA1 faaliyetleri ile özünde yönetilir. mitokondri mücadele fizyon ve füzyon olayları dengesi bir hücrede kararlı durum mitokondriyal şeklini belirler. Örneğin, mitokondriyal fisyon bastırılması, tam ve rakipsiz füzyon neden olur mitokondri aşırı aktivitesi sırasındal fisyon mitokondri 3 parçalanmasına neden olur.
mitokondriyal yapı-fonksiyon ilişkisinin incelenmesi öncelikle iki ücretsiz yaklaşımları içerir: a) mitokondriyal fisyon / füzyon proteinlerinin genetik manipülasyon sonra hücresel ve organizma fenotip analizi ve b) mitokondriyal yapı ve fonksiyonunun doğrudan değerlendirmeler. Fenotipleri ikincil etkileri nedeniyle ortaya çıkabilecek genetik analizler hep, (bu durumda, mitokondriyal fisyon / füzyon proteinleri olarak) eldeki molekülün doğrudan işlevselliğini ortaya olmayabilir dikkat çekicidir. Bu nedenle, geliştirmek ve doğrudan mitokondriyal yapı ve işlevlerini incelemek için araçları kullanmak için büyük önem taşımaktadır. mitokondriyal yapının herhangi bir değerlendirme çeşitli mikroskopi araçları içerir. mitokondriyal dinamizm hem nitel hem Quantität izlenebilir beri canlı hücre floresan mikroskobu kullanımı büyük ölçüde, mitokondriyal dinamikleri çalışmalar ilerlemiştirUygun floresan mikroskopi araçları ve teknikleri 8 kullanarak ively. Floresan mikroskopi tabanlı araç vivo 9 mitokondriyal dinamizm önemini açıklık, canlı ve sabit Drosophila melanogaster dokularında mitokondriyal yapısını ve işlevini incelemek için geliştirilmiştir. Bu ve ilgili yöntemler Drosophila yumurtalık mitokondriyal yapı ve fonksiyona okuyan amacı ile, burada açıklanmıştır.
Drosophila yumurtalık germarium 10,11 bulunan ilgili yetişkin kök hücrelerden ortaya çıkan tohum çizgisi ve somatik soy oluşur. Onaltı sinsityal germ hücreleri (KR) germarium (Şekil 1) ortaya çıktığını bireysel yumurta odaları oluşturmak için somatik folikül hücreleri (FC) tarafından kapsüle olsun. 16 GClerin biri bir oosit olmaya kararlıdır olsun ve kalan 15 GC'ler oosit odasının büyümesini destekleyen hemşire hücrelerine dönüşebilirBu serilir önce yumurtanın olgunlaşmasını kolaylaştırmak. onlar ölümcül ön folikül hücreleri (AFCS), arka folikül hücreleri (PFC) ve ana gövde hücrelerinden oluşan bir desenli epitel hücre katmanı içine ayırt etmek için mitotik hücre döngüsü çıkmadan önce FC'lerin çoğunluğu mitotik bölünmeleri 9 mermi tabi (MBCS) . birbirini takip eden yumurta odaları aynı zamanda erken gelişme FCS türetilen hücreler ayrılır sap hücreleri tarafından bağlanır. Mitokondriyal fisyon protein Drp1 tarafından düzenlenen mitokondriyal şekil aktif Drosophila over FC tabakasının 9,12 normal gelişimi sırasında farklılaşma sürecine dahil edilmektedir. Drosophila folikül hücre katmanı gelişiminde Drp1 katılımını tanımlamak için bu çalışmalarda kullanılan yöntemler burada açıklanmaktadır.
Protocol
Representative Results
Discussion
Protokol çerçevesinde kritik adımlar
Photobleaching: floresan numunelerin aşırı photobleaching önlenmesi verimli konfokal mikroskopi gerçekleştirmek için kesinlikle gereklidir. Bu nedenle, mercek aracılığıyla numune bulmak için ya da canlı tarama modu ile görüntü elde etme parametrelerini ayarlamak için kullanılan zaman photobleaching en aza indirmek için minimize edilmelidir.
Doku hasarı: mitokondri hücresel sağl?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We acknowledge Leena Patel and Diamond Woodard for helping in the Drosophila medium preparation and Dr. Igor Chesnokov for providing access to the camera-attached stereomicroscope.
Materials
| Grace's Media (Insect Dissecting Medium) | Fisher Scientific | 30611031-2 | |
| 41 Paraformaldehyde AQ | Electronic Microscopy Sciences | 50-259-99 | |
| Mitotracker Green (overall mitochondrial stain) | Life Technologies | m7514 | Reconstitute and Aliquot |
| Tetramethylrhodamine ethyl ester perchlorate | Sigma Aldrich | 87917-25MG | Reconstitute and Aliquot |
| MitoSox (Mito-Ros stain) | Life Technologies | m36008 | Reconstitute and Aliquot |
| PolyLysine | MP Biomedicals | ICN15017625 | |
| Fly Vials | Fisher Scientific | AS-515 | |
| Fly Conicals | Fisher Scientific | AS-355 | |
| Fly Vial Flugs | Fisher Scientific | AS273 | |
| Fly Conical Flugs | Fisher Scientific | AS 277 | |
| Jazzmix Drosophila food (Drosophila food) | Fisher Scientific | AS153 | |
| Bovine Serum Albumin | Sigma Aldrich | A9647-50G | |
| Cyclin E Antibody (d-300) | Santa Cruz | sc- 33748 | |
| ATPB antibody [3D5] – Mitochondrial Marker | AbCam | ab14730 | |
| Cy3 AffiniPure Goat Anti-Mouse IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 115-165-146 | |
| Cy5 AffiniPure Goat Anti-Rabbit IgG (H+L) | Jackson ImmunoResearch | 111-175-144 | |
| Hoechst | Fisher Scientific | H3570 | |
| VectaShield | Fisher Scientific | H100 | |
| Azer Scientific EverMark Select Microscope Slides | Fisher Scientific | 22-026-252 | |
| Microscope Cover Glass | Fisher Scientific | 12-542-B | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Mat Tek Corp Glass Bottom Mircrowell Dish | Fisher Scientific | P35G-0-14-C | |
| Active Dried Yeast | Fisher Scientific | ICN10140001 | |
| Confocal Microscope | Carl Zeiss | LSM 700 | |
| Dumont #5 Forceps | Fine Science Technologies | 11251-20 | |
| Moria Nickel Plated Pin Holder | Fine Science Technologies | 26016-12 | |
| Minutien Pins | Fine Science Technologies | 26002-15 | |
| MYFP ( w[*]; P{w[+mC]=sqh-EYFP-Mito}3 ) | Bloomington Stock Center | 7194 | |
| Fly Pad | Fly stuff | 59-118 | |
| Blowgun | Fly stuff | 54-104 | |
| Blowgun needle | Flystuff | 54-119 | |
| Dissecting Microscope | Carl Zeiss | Stemi 2000 | |
| Analyses software | Carl Zeiss | Zen | |
| Analyses software | Open source | Image J | |
| Research Macro Zoom Microscope | Olympus | MVX10 | |
| QICAM Fast 1394 Cooled Digital Camera, 12-bit, Mono | QImaging | QIC-F-M-12-C | |
| QCapture Pro 5.1 | QImaging |
References
- Nunnari, J., Suomalainen, A. Mitochondria: in sickness and in health. Cell. 148 (6), 1145-1159 (2012).
- Youle, R. J., van der Bliek, A. M. Mitochondrial fission, fusion, and stress. Science. 337 (6098), 1062-1065 (2012).
- Mitra, K. Mitochondrial fission-fusion as an emerging key regulator of cell proliferation and differentiation. Bioessays. , (2013).
- Kageyama, Y., Zhang, Z., Sesaki, H. Mitochondrial division: molecular machinery and physiological functions. Curr Opin Cell Biol. 23 (4), 427-434 (2011).
- Chen, H., Chan, D. C. Physiological functions of mitochondrial fusion. Ann N Y Acad Sci. 1201, 21-25 (2010).
- Liesa, M., Shirihai, O. S. Mitochondrial dynamics in the regulation of nutrient utilization and energy expenditure. Cell Metab. 17 (4), 491-506 (2013).
- Hoppins, S. The regulation of mitochondrial dynamics. Curr Opin Cell Biol. 29, 46-52 (2014).
- Mitra, K., Lippincott-Schwartz, J. Chapter 4, Analysis of mitochondrial dynamics and functions using imaging approaches. Curr Protoc Cell Biol. Chapter. , 21-21 (2010).
- Mitra, K., Rikhy, R., Lilly, M., Lippincott-Schwartz, J. DRP1-dependent mitochondrial fission initiates follicle cell differentiation during Drosophila oogenesis. J Cell Biol. 197 (4), 487-497 (2012).
- Klusza, S., Deng, W. M. At the crossroads of differentiation and proliferation: precise control of cell-cycle changes by multiple signaling pathways in Drosophila follicle cells. Bioessays. 33 (2), 124-134 (2011).
- Sahai-Hernandez, P., Castanieto, A., Nystul, T. G. Drosophila models of epithelial stem cells and their niches. Wiley Interdiscip Rev Dev Biol. 1 (3), 447-457 (2012).
- Parker, D. J., et al. A new mitochondrial pool of cyclin E, regulated by Drp1, is linked to cell-density-dependent cell proliferation. J Cell Sci. 128 (22), 4171-4182 (2015).
- Mitra, K., Wunder, C., Roysam, B., Lin, G., Lippincott-Schwartz, J. A hyperfused mitochondrial state achieved at G1-S regulates cyclin E buildup and entry into S phase. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (29), 11960-11965 (2009).
- Shidara, Y., Hollenbeck, P. J. Defects in mitochondrial axonal transport and membrane potential without increased reactive oxygen species production in a Drosophila model of Friedreich ataxia. J Neurosci. 30 (34), 11369-11378 (2010).
- Zielonka, J., Kalyanaraman, B. Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth. Free Radic Biol Med. 48 (8), 983-1001 (2010).
- Haack, T., Bergstralh, D. T., St Johnston, D. Damage to the Drosophila follicle cell epithelium produces "false clones" with apparent polarity phenotypes. Biol Open. 2 (12), 1313-1320 (2013).
- Murphy, M. P. How mitochondria produce reactive oxygen species. Biochem J. 417 (1), 1-13 (2009).
- Mandal, S., Guptan, P., Owusu-Ansah, E., Banerjee, U. Mitochondrial regulation of cell cycle progression during development as revealed by the tenured mutation in Drosophila. Dev Cell. 9 (6), 843-854 (2005).
- Tipping, M., Perrimon, N. Drosophila as a model for context-dependent tumorigenesis. J Cell Physiol. 229 (1), 27-33 (2014).
- Herranz, H., Eichenlaub, T., Cohen, S. M. Cancer in Drosophila: Imaginal Discs as a Model for Epithelial Tumor Formation. Curr Top Dev Biol. 116, 181-199 (2016).
- Pandey, U. B., Nichols, C. D. Human disease models in Drosophila melanogaster and the role of the fly in therapeutic drug discovery. Pharmacol Rev. 63 (2), 411-436 (2011).
