Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between the T-cell receptor and tumor antigens, presented by human leukocyte antigens, governs T-cell functionality; these methods include protein production, X-ray crystallography, biophysics, and functional T-cell experiments.
Human CD8+ cytotoxic T lymphocytes (CTLs) are known to play an important role in tumor control. In order to carry out this function, the cell surface-expressed T-cell receptor (TCR) must functionally recognize human leukocyte antigen (HLA)-restricted tumor-derived peptides (pHLA). However, we and others have shown that most TCRs bind sub-optimally to tumor antigens. Uncovering the molecular mechanisms that define this poor recognition could aid in the development of new targeted therapies that circumnavigate these shortcomings. Indeed, present therapies that lack this molecular understanding have not been universally effective. Here, we describe methods that we commonly employ in the laboratory to determine how the nature of the interaction between TCRs and pHLA governs T-cell functionality. These methods include the generation of soluble TCRs and pHLA and the use of these reagents for X-ray crystallography, biophysical analysis, and antigen-specific T-cell staining with pHLA multimers. Using these approaches and guided by structural analysis, it is possible to modify the interaction between TCRs and pHLA and to then test how these modifications impact T-cell antigen recognition. These findings have already helped to clarify the mechanism of T-cell recognition of a number of cancer antigens and could direct the development of altered peptides and modified TCRs for new cancer therapies.
Røntgenkrystallografi har vært, og vil fortsette å være, en ekstremt kraftig teknikk for å forstå innholdet av ligand-reseptor interaksjoner. Ved å visualisere disse vekselvirkninger i atom detalj, er det ikke bare mulig å avsløre de molekylære mekanismene som regulerer mange biologiske prosesser, men det er også mulig direkte å endre kontakt grensesnitt for terapeutisk effekt. Sammen med teknikker som overflate-plasmonresonans og isotermisk titrering kalorimetri (for å nevne et par), kan slike modifikasjoner så analyseres biophysically for å vurdere den direkte innvirkning på bindingsaffinitet, interaksjon kinetikk, og termodynamikk. Til slutt, ved å utføre funksjonelle forsøk på relevante celletyper, et detaljert bilde av molekyl og funksjonelle virkningen av endringer i reseptor-ligand interaksjoner kan merkes, og gir meget spesifikk mekanistisk informasjon. Samlet er disse typene av metoder gi en atom oppløsning bildet slik at det avskrekke melse av hvordan biologiske systemer fungerer, med tilhørende konsekvenser for diagnostiske og terapeutiske fremskritt.
Vårt laboratorium benytter rutinemessig disse teknikkene for å studere reseptorer som medierer human T-celle-immunitet mot patogener og kreft, i autoimmunitet, og under transplantasjon. Her fokuserer vi på det menneskelige CD8 + T-celle respons til kreft, formidlet av en interaksjon mellom T-celle reseptor (TCR) og human leukocytt antigen (HLA) -restricted tumor-avledede peptider (phla). Dette er viktig fordi, selv om CD8 + T-celler er i stand til å målrette kreftceller, har vi og andre tidligere vist at anti-cancer TCR suboptimalt binder seg til deres kognate phla 1, 2. Således har mange laboratorier forsøkt å endre enten den TCR 3, 4, 5 eller peptidet ligand 6,class = "xref"> 7, 8 for å øke immunogenisiteten, og for å bedre mål-kreftceller. Men disse metodene er ikke alltid effektive og kan ha alvorlige bivirkninger, inkludert off-target toksisitet 4, 9, 10. Videre forskning utforske de molekylære mekanismene som styrer T-celle anerkjennelse av kreft antigener vil være avgjørende for å overvinne disse manglene.
I denne studien har vi fokusert på svarene mot autologe melanomceller av CD8 + T-celler som er spesifikke for et fragment av differensiering melanocyte antigen glykoprotein 100 (gp100), gp100 280-288, presentert av HLA-A * 0201 (den vanligste -expressed menneskelig phla klasse I). Dette antigenet har vært mye studert mål for immunterapi melanom og har blitt utviklet som en såkalt "heteroclitic" peptid hvor en valin erstatter alaninanker posisjon 9 til å forbedre phla stabilitet 11. Denne tilnærmingen ble anvendt for å forsterke induksjon av melanom-reaktive CTL in vitro og har blitt brukt i kliniske studier 12. Imidlertid kan modifikasjoner av peptid-rester har uforutsigbare effekter på T-celle-spesifisitet, demonstreres ved den dårlige effektiviteten av de fleste heterolitic peptider i klinikken 6, 13. Faktisk, en annen heteroclitic form av gp100 280-288, hvor peptid rest Glu3 ble byttet ut med Ala, opphevet anerkjennelse av en polyklonal populasjon av gp100 280-288-spesifikke T-celler 14, 15. Vi har tidligere vist at selv små forandringer i peptid anker rester kan vesentlig endre T-celle-gjenkjennelse på uforutsigbare måter 6, 16. Dermed studien fokusert på building et mer detaljert bilde av hvordan CD8 + T-celler gjenkjenner GP100 og hvordan modifikasjoner av samspillet mellom TCR og phla kan påvirke denne funksjonen.
Her, genererte vi meget rene, løselige former av to TCR spesifikke for gp100 280-288 presentert av HLA-A * 0201 (A2-YLE), så vel som de naturlige og endrede former av phla. Disse reagenser ble anvendt for å danne proteinkrystaller for å løse det ternære atomstrukturen til en human TCR i kompleks med heteroclitic form av A2-YLE, samt to av de mutante pHLAs i unligated form. Vi brukte deretter et peptid skanning tilnærming for å demonstrere virkningen av peptid erstatninger på TCR ved å utføre in-depth biofysiske eksperimenter. Til slutt, genererte vi en genetisk modifisert CD8 + T-cellelinje, omprogrammeres for å uttrykke en av A2-YLE-spesifikke TCR, for å utføre funksjonelle eksperimenter for å teste den biologiske virkningen av de forskjellige peptid modifikasjoner. Disse data viser at selv modisifikasjoner mot peptid rester som er utenfor TCR bindende motiv kan ha uforutsigbare ringvirkninger på tilstøtende peptid rester som oppheve TCR bindende og T-celle anerkjennelse. Våre funn representerer den første eksempel på de strukturelle mekanismer som ligger under T-celle-gjenkjennelse av denne viktig terapeutisk mål for melanom.
Protokollene er skissert her gir et rammeverk for den molekylære og celle disseksjon av T-celle responser i sammenheng med menneskelig sykdom. Selv om kreft var hovedfokus i denne studien har vi brukt svært lignende metoder for å undersøke T-celle responser på virus 32, 33, 34, 35, 36, 37 og under autoimmunitet 38, 39, 40. Videre har vi brukt disse teknikkene i videre forstand til å forstå de molekylære prinsipper som styrer T-celle antigen anerkjennelse 2, 19, 41, 42. Faktisk, den uforutsigbare natur modifikasjoner peptid rester, selv deutenfor av TCR kontakt rester, har konsekvenser T-celle anerkjennelse viktige implikasjoner for utforming av heteroclitic peptider. Disse funnene direkte har bidratt til utviklingen av nye T-celle-terapi, inkludert peptid-vaksiner 6, 43 og kunstige høy affinitet TCR 3, 4, 5, 20, 44, såvel som forbedret diagnostikk 45, 46, 47.
Kritiske trinnene i protokollen
Generering av en høyren, funksjonelt protein er viktig for alle metodene beskrevet i dette dokumentet.
Modifikasjoner og feilsøking
Vanskeligheter med å generere svært ren protein ofte knyttet til uttrykk for høyt-Ren, uoppløselig IBer fra E. coli-ekspresjonssystemet. Vanligvis endrer uttrykket protokollen (f.eks induserende på ulike optiske tettheter, ved hjelp av ulike E. coli-stammer, eller ved hjelp av ulike medier formasjoner) løser disse problemene.
Begrensninger av teknikken
Disse teknikker gjør bruk av oppløselige proteinmolekyler (TCR og phla) som normalt blir uttrykt på celleoverflaten. Derfor er det viktig å sikre at strukturelle / biofysiske funn er i overensstemmelse med cellulære tilnærminger for å bekrefte biologisk betydning.
Betydningen av teknikken med hensyn på eksisterende / alternative metoder
Gjennom bruk av røntgenkrystallografi og biofysikk bekreftet gjennom funksjonsanalyse, har vi og andre har vist at TCR spesifikke for kreft epitoper er generelt preget av lave bindingsaffiniteter 48. Denne lave TCR affinitet kan bidra til å forklare hvorfor T-celler are ikke naturlig effektiv på å fjerne kreft. Høy oppløsning atomstruktur av komplekser mellom anti-kreft TCR og beslektede tumorantigener begynner å avdekke den molekylære basis for denne svake affinitet. Videre disse studiene er nyttig for å bestemme hvilke mekanismer som ligger bak de terapeutiske intervensjoner utformet for å overvinne dette problemet, såing fremtidige forbedringer 16. I denne studien undersøkte vi den første strukturen i en naturlig forekommende αβTCR i kompleks med en gp100 HLA-A * 0201-begrenset melanom epitop. Strukturen, kombinert med en grundig biofysiske undersøkelse, viste den samlede binding modus av samspillet. Vi har også oppdaget en uventet molekyl bryter, som skjedde i en mutert form av peptidet, som avskaffet TCR binding (vurdert ved hjelp av overflate-plasmonresonans) og CD8 + T-cellegjenkjenning (funksjonell eksperimenter). Det var bare mulig å demonstrere denne nye mekanismen av HLA-antigen presentatiom bruk av høyoppløselige metoder beskrevet.
Fremtidige applikasjoner eller retninger etter å mestre denne teknikken
Samlet våre resultater demonstrere makt røntgenkrystallografi og biofysiske metoder kombinert med robuste funksjonsanalyser. Ved hjelp av disse metodene, er det mulig å dissekere ut presise molekylære mekanismene som regulerer T-celle-gjenkjenning av antigen. Faktisk er det også mulig å bruke denne tilnærmingen for å løse strukturen av unligated TCR, som viser hvordan konformasjonsendringer kan spille en rolle under antigen diskriminering 49, 50, 51. En bedre forståelse av den svært komplekse og dynamiske natur som underbygger TCR-phla interaksjoner har også åpenbare implikasjoner for terapi design. Å være i stand til direkte å "se" molekylene som blir målrettet terapeutisk, samt den virkning at modifikasjoner har på antigen recognition, vil helt klart forbedre utviklingen av disse medisinene fremover. I denne studien viser vi at selv endringer i et enkelt peptid rest som ikke er tungt engasjert av en TCR kan uforutsigbart overføre strukturelle endringer i andre rester i den HLA-bundet peptid, som i sin tur endrer dramatisk T-celle-gjenkjennelse. En mer fullstendig forståelse av de molekylære mekanismene som benyttes i løpet av T-celle-gjenkjenning av antigen vil være svært fordelaktig ved utforming av fremtidige terapier for et vidt spekter av humane sykdommer.
The authors have nothing to disclose.
BM er støttet av en Cancer Research UK PhD student. AG er støttet av en Life Science Research Network Wales PhD student. VB er støttet av en Cancer Research Wales PhD student. DKC er et Wellcome Trust Forskning Karriereutvikling Fellow (WT095767). AKS er et Wellcome Trust etterforsker. GHM er finansiert av en felles Life Science Research Network Wales og Tenovus Cancer Care PhD Studentship. Vi takker de ansatte på Diamond Light Source for å skaffe utstyr og støtte.
S.O.C. media | Invitrogen |
Orbi-Safe New Orbit incubator | Sanyo |
carbenicillin | Sigma |
IPTG | Fisher |
Quick Coomassie Stain SafeStain | Generon |
Legend RT centrifuge | Sorvall |
Tris | Fisher |
magnesium chloride | Arcos |
NaCl | Fisher |
glycerol | Sigma-Aldrich |
Sonopuls HD 2070 | Bandelin |
DNAse | Fisher |
Triton | Sigma-Aldrich |
EDTA | Fisher |
guanidine | Fisher |
NanoDrop ND1000 | Thermo |
Peptides | Peptide Protein Research |
dithiothreitol | Sigma-Aldrich |
L-arginine | SAFC |
cysteamine | Fisher |
cystamine | Fisher |
dialysis tubing | Sigma-Aldrich |
urea | Sigma-Aldrich |
Metricel 0.45 μm membrane filter | Pall |
POROS 10/100 HQ | Applied biosystems |
ÄKTA pure FPLC system | GE Healthcare Life Sciences |
10 kDa MWCO Vivaspin 20 | Sartorius |
10 kDa MWCO Vivaspin 4 | Sartorius |
Superdex 200 10/300 GL column | GE Healthcare Life Sciences |
Phosphate Buffer Saline | Oxoid |
BIAcore buffer HBS | GE Healthcare Life Sciences |
Biotinylation kit | Avidity |
BIAcore T200 | GE Healthcare Life Sciences |
CM5 chip coupling kit | GE Healthcare Life Sciences |
streptavidin | Sigma-Aldrich |
Microcal VP-ITC | GE Healthcare Life Sciences |
Hepes | Sigma-Aldrich |
Gryphon crystallisation robot | Art Robbins Instruments |
Intelli-plate | Art Robbins Instruments |
Crystallisation screens and reagents | Molecular Dimensions |
75 cm2 flask | Greiner Bio-One |
0.22 μm filters | Miller-GP, Millipore |
Ultra-Clear ultracentrifuge tube | Beckman Coulter |
Optima L-100 XP with SW28 rotor | Beckman Coulter |
CD8 microbeads | Miltenyi Biotec |
anti-CD3/CD28 Dynabeads | Invitrogen |
anti-PE microbeads | Miltenyi Biotec |
CK medium, PHA | Alere Ltd |
anti-TCRVβ mAb | BD |
dasatinib | Axon |
MIP-1β and TNFα ELISA | R&D Systems |
51Cr | PerkinElmer |
1450 Microbeta counter | PerkinElmer |