The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
학습은 메모리 트레이스 및 유지 보수의 형성에 기초한다. 널리 하나의 기본 메커니즘은 신경 세포 사이에 존재하는 시냅스 접촉의 새로운 및 / 또는 재배치의 활동에 의존 형성을 나타낼 수 있음을 인정한다. 분자 수준에서 다양한 단백질 변형, 세포 내 relocalizations과 시냅스 단백질의 회전율의 변화 1-4 (LAMPRECHT을 2004 년 # 8) 설명 하였다. 그러나 대부분의 연구는 지금까지 오히려 글로벌 그러나 복잡한 시냅스 프로테옴 조성에보다 선택 단백질에 초점을 맞추었다. 본 방법은 학습 실험 후 마우스 뇌 영역에서 시냅스 프로테옴의 변화에 대한 공정한 심사를 할 수 있습니다. 이 시냅스 아키텍처의 학습에 의한 구조 조정의 시간 – 포인트 의존 분자 스냅 샷을 렌더링하기에 적합합니다. 설명 된 워크 플로는 동물 행동, 단백질 생화학, 질량 분석 및 bioi 다른 전문가의 특정 팀워크를 필요nformatics.
선택된 학습 패러다임, 즉 주파수 변조 톤 차별 (FMTD)는 설치류 5에서 잘 특징 청각 차별 작업입니다. 이 셔틀 박스로 이동 / 학습과 장기 기억 형성 없음 고우 태스크 증가 피질 도파민 시그널링 및 단백질 합성에 따라 메커니즘을 포함한다. 따라서, 게르 빌 루스 쥐와 쥐에 최근 단백체 연구는 도파민과 대뇌 피질에서 시냅스 구성 요소의 학습에 의한 플라스틱 재 배열뿐만 아니라, 가정 FMTD의 학습과 기억 6 ~ 8시 상호 작용을 더 기저 뇌 영역에 보여집니다. 이 기억 형성 다양한 뇌 영역의 복잡한 상호 작용을 포함하므로, 차분 프로테옴 수준에서 이러한 영역들 내에서 조정될 수 있음을 나타낸다. 따라서, 선택 피질 및 피질 마우스 뇌 영역의 해부는 워크 플로에 포함되어 있습니다.
또한, 신뢰성 characterizati심지어 시냅스 단백질 성분에 약한 변화에 사전 및 시냅스 구획의 농축이 아닌 균질 또는 원유 막 분수 (9)의 분석을 필요로한다. 종래 단백질체 분석에 따라서, 시냅 토좀 (synaptosome)의 제조에 이용하는 단계 확립 프로토콜 검출 레벨과 시냅스 특정 단백질 10,11위한 동적 범위를 증가시키기 위해 설명된다.
정량적 목적 라벨없는 고해상도 질량 분석을 사용하는 필수 전제 조건은 단백질 샘플의 높은 유사도이다. 로 시냅스 단백질 조성이 아니라 사소한 변경, 라벨없는 접근 방식은 훈련과 순진 생쥐에서 얻은 단백질 샘플을 대응하는 비교하는 것이 적합 할 것이다 학습 후에 발생할 것으로 예상된다. 또한, 안정 동위 원소 (예 : TMT, iTRAQ, ICPL 및 SILAC)과 MS2 기반 라벨 무료 …로서를 사용하여 단백질 / 펩티드의 조건 – 특정 레이블 전략ntification (SWATH)이 유용하지만, 이들은 선택된 라벨없는 접근법보다 더 비싼 특수 질량 분석 하드웨어가 필요하다.
단백체 검사는 종종 복잡한 데이터 세트를 생성하기 때문에, 생물 정보학 처리가 적절한 데이터 해석을 권장합니다. 추가 메타 분석은 패러다임 관련 변경 사항 및 관련 핵심 세포 프로세스 및 신호 전달 경로의 식별을 기본 잠재적 인 분자 메커니즘의 더 나은 이해를 지원할 수있다. 적절한 방법은 아래에 설명되어 있습니다.
이 연구는 학습과 생쥐의 다른 뇌 영역 메모리 통합 동안 시냅스 단백질 발현 변화의 정확한 정량 프로파일에 최적화 된 방법론 워크 플로우를 제공합니다. 설치는 질량 분석 분석을위한 샘플 당 적어도 세 기술 복제의 필요한 응용 프로그램의에도 불구하고 단일 동물의 수준에서 단백질 발현을 연구 할 수있는 기회를 제공합니다.
방법론이 고려 고분자 지지체 단백질로 이루어진 사전 및 postsynapse의 특정 단백질 조성물을 얻어 아니라 중간 또는 낮은 분자량 담지 중요한 매개체 단백질. synaptosomal 준비의에서-솔루션 다이제스트 효율적인 세대가 발생하고, 따라서 발판 유래 펩티드의 과잉 표현입니다. 이는 차례로, 더 작은 또는 저급 풍부한 단백질의 분석을 억제 할 수있다. 에서 SDS-PAGE 분획의 제안 준비평행 인 – 겔 소화 과정과 함께 각각의 샘플의 분취 량 중저 풍부한 단백질의 분석을 용이하게하고, 추천 상보적인 방법을 나타낸다. 샘플 유래의 모든 분획의 분리 질량 분석 도포 후 (인 용액 다이제스트 예에서 겔 결합 포스 – 풍부 분획 다이제스트)에 대응하는 MS / MS 데이터 세트 합하고 상기 PEAKS 의한 단백질 확인 및 정량을 위해 계산 될 수있다 소프트웨어 나 다른 인기있는 소프트웨어 패키지.
대안 적으로, 인 용액 절단 샘플의 생성에 겔 소화 유래 시료의 분획 (시료 차선 별도로 처리 겔 부분) 및 분획의 개별 애플리케이션이 증가 할 수 질량 스펙트럼 (이온 교환 크로마토 그래피에 의해 예) 분석 깊이. 그러나,이 확장 된 워크 플로우를 극적으로 LS-MS / MS 데이터 수집에 필요한 시간을 증가시킨다. generatio에 대한프로테옴 프로파일의 지정된 시간 코스를 학습과 기억 형성 동안 시냅스 단백질의 재 배열의 상세한 분자 시퀀스의 N이 필요합니다. 동물의 성능 후 약 학습 곡선의 점근 적 수준에 도달 할 때까지이 시간 코스는 후 또는 첫 번째 훈련 세션 동안 즉시 시작하고 확대 메시 시간 프레임을 커버 할 수있다. 8 – 훈련 10 일 (자세한 내용은 그림 2 참조).
시냅스 단백질의 인산화 변화의 분석은 FMTD 학습하는 동안 선택된 시간 프레임에서 특정 초점을 필요로한다. 단백질 인산화와 dephosphorylations에 의해 유발되는 것으로 알려져 시냅스 단백질의 재 배열을 개시 한 손으로 신호 폭포에서 동물 훈련의 초기 단계에서 예상된다. 한편, (S) 내에 연결 및 조립을 조절 알려진 여러 시냅스 인산화 단백질의 장기적인 변형이 존재ynaptic 건축 19, 20. 이러한 번역 후 변형에도 메모리 통합 이후 시점에서 예상된다.
이 단백체 워크 플로우에 의해 생성 된 복잡한 데이터 세트 분자 경로 및 주요 분자를 참여 식별하기 위해 생물 정보학 처리를 필요로한다. 메타 분석은 학습과 기억 과정에 중요한 역할을 크게 부풀려 경로를 보여줍니다.
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
C57BL/6J mice | Charles River | ||
Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
Formic acid | Fluka | 14265 | |
GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
Gephi | https://gephi.org/ | ||
Glycerol | AppliChem | A1123 | |
Glycine | AppliChem | A1067 | |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
RapiGest | Waters | 186002122 | |
Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
Urea | AppliChem | A1049 | |
Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |