The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.
The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.
High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.
Lärande bygger på bildandet av minne spår och deras underhåll. Det är allmänt accepterat att en bakomliggande mekanismen kan representera en aktivitetsberoende bildandet av nya och / eller omfördelning av befintliga synaptiska kontakter mellan nervceller. På molekylär nivå har olika proteinmodifieringar, subcellulära relocalizations och förändringar i omsättningen av synaptiska proteiner har beskrivits 1-4 (Lamprecht, 2004 # 8). De flesta studier hittills fokuserat på utvalda proteiner snarare än på den globala men komplexa synaptiska Proteome komposition. Föreliggande tillvägagångssätt gör en opartisk screening för synaptiska Proteome förändringar i mus hjärnregioner efter en inlärningsexperiment. Den är lämplig för att göra time-point osjälvständiga molekylära ögonblicksbilder av lärande-inducerad omorganisation av den synaptiska arkitektur. Den beskrivna arbetsflödet kräver en särskild lagarbete av olika specialister i djurens beteende, proteinbiokemi, masspektrometri och Biolnformatics.
Den valda lärande paradigm, dvs. frekvensmodulerade tonen diskriminering (FMTD), är en väl karakteriserad auditiv diskriminering uppgift i gnagare 5. Lärande och långtidsminnet bildning i denna buss rutan Go / No-Go-uppgift innebär mekanismer beroende på ökad kortikal dopaminsignaler och proteinsyntes. Följaktligen senaste proteomik studier på gerbiler och möss avslöjade dopamin- och lärande-inducerad plast omdisponeringar av synaptiska komponenter i kortikal, men också i mer basala hjärnregioner som förmodligen interagerar under FMTD inlärning och minne 6-8. Detta visar att minnesbildning innebär ett komplext samspel av olika områden i hjärnan och därmed kan differentiellt regleras inom dessa områden på proteomet nivå. Därför är dissekering av utvalda kortikala och subkortikala mus hjärnregioner som ingår i arbetsflödet.
Vidare tillförlitlig characterizatiom även av svaga förändringar i synaptiska proteinsammansättning kräver en anrikning av pre-och postsynaptiska fack snarare än analys av homogen eller råa membranfraktioner 9. Därför framställning av synaptosomer med utnyttjande etablerade protokoll före proteomik analys beskrivs i syfte att höja nivån upptäckt och det dynamiska omfånget för synaps specifika proteiner 10,11.
En viktig förutsättning för att använda etikettfria högupplösande masspektrometri för kvantitativa ändamål är en hög grad av likhet av proteinprover. Som ganska små förändringar i synaptiska proteinsammansättning förväntas inträffa efter lärande, en etikett-fri strategi kommer att vara lämpligt att jämföra motsvarande proteinprover som erhållits från utbildade och naiva möss. Alternativt sjukdomsspecifika etikett strategier proteiner / peptider med hjälp av stabila isotoper (t.ex. TMT, iTRAQ, ICPL och SILAC) samt MS2-baserade etikett fri quantification (LIETAG) är användbara, men de är dyrare än den valda etiketten fria metod eller behöver speciell massa hårdvara spektrometrisk.
Eftersom proteomik visningar ofta ger komplexa datamängder, är bioinformatik behandling rekommenderas för lämplig tolkning av data. Ytterligare meta-analyser kan stödja en bättre förståelse av potentiella molekylära mekanismerna bakom paradigm relaterade förändringar och identifiering av berörda viktiga cellulära processer och signalvägar. Lämpliga metoder beskrivs också nedan.
Studien presenterar en metod arbetsflöde optimerad för en noggrann kvantitativ profilering av synaptiska protein uttryck förändringar under inlärning och minne konsolidering inom olika områden i hjärnan på möss. Installations ger möjlighet att studera proteinuttryck på nivån för ett enda djur trots önskat program på minst tre tekniska replikat per prov för masspektrometrisk analys.
Metodiken tar hänsyn till den särskilda proteinsammansättning av pre- och postsynapsen bestående av högmolekylära ställnings proteiner utan också viktiga förmedlarproteinerna bär medium eller lägre molekylvikt. De in-lösning klyvningar av synaptosomala preparat resulterar i en effektiv produktion och därmed en överrepresentation av byggnadsställning-härledda peptider. Detta, i sin tur, kan undertrycka analys av mindre eller lägre rikliga proteinerna. Den föreslagna beredningen av SDS-PAGE-fraktioner från enalikvot av varje prov kombinerades med en uppslutningsförfarandet parallellt in-gel underlättar analysen av medium och låg abundans proteiner och representerar en mycket rekommenderade kompletterande metod. Efter separat masspektrometrisk tillämpning av alla fraktioner som härrör från ett prov (t.ex. in-lösning smälta i-gel smälta kombinerade Fosfor-berikade fraktioner) motsvarande MS / MS dataset kan kombineras och vidare beräknat för identifiering protein och kvantifiering av toppar programvara eller alternativa populära programpaket.
Alternativt i enskilda fall är in-gel-digestion-härledda fraktioner av ett prov (separat bearbetade gel-områden i ett prov lane) och fraktioner som alstras av in-lösning kokade provet (t.ex. genom jonbyteskromatografi) för masspektrometri kan öka den analytiska djup. Emellertid ökar detta utökade arbetsflöde dramatiskt den tid som krävs för LS-MS / MS datainsamling. för genen av en detaljerad molekylär sekvens av synaptiska protein omlagringar under inlärning och minnesbildning en specificerad tidsförloppet för proteomic profiling krävs. Detta tidsförlopp kan starta omedelbart efter eller även under första träningspasset och täcker en finmaskigt tidsram tills djurens prestation nådde asymptotisk nivå av inlärningskurvan efter ca. 8 – 10 dagars utbildning (se figur 2 för detaljer).
Analysen av fosforylering förändringar i synaptiska proteiner kräver ett särskilt fokus på de valda tidsramar under FMTD lärande. Å ena sidan signaleringskaskader initierar synaptiska protein omflyttningar kända utlösas av proteinfosforyleringar och defosforyleringar förväntas vid mycket tidiga stadier av animaliskt utbildning. Å andra sidan finns det långvariga ändringar av flera fosforylerade synaptiska proteiner som är kända som reglerar anslutning och montering inom synaptic arkitektur 19, 20. De posttranslationella modifieringar förväntas även vid en senare tidpunkt minne konsolidering tid.
De komplexa datamängder som genereras av denna proteomik arbetsflöde kräver bioinformatisk behandling för att identifiera deltagande molekylära vägar och viktiga molekyler. Meta-analys visar betydande överrepresenterade vägar, som spelar en roll i inlärnings- och minnesprocesser.
The authors have nothing to disclose.
We wish to thank Yvonne Ducho and Kathrin Pohlmann for excellent technical assistance. This work was supported by the Deutsche Forschungsgemeinschaft (SFB 779) and by the State Saxony-Anhalt / European Regional Development Fund (ERDF) via the Center for Behavioral Brain Sciences (CBBS).
3M Empore Solid Phase Extraction- Filter | 3M Bioanalytical Technologies | 4245SD | 7 mm/3 ml |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164564 | 100 µm x 2 cm, C18 |
Acclaim PepMap 100 | Dionex/Thermo Scientific | 164569 | 75 µm x 25 cm, C18 |
Acetic acid | Carl Roth GmbH | 3738.1 | |
Acetonitrile (ACN) | Carl Roth GmbH | AE70.2 | |
Acrylamide (30%) | AppliChem | A0951 | |
Ammonium hydrogen carbonate | Fluka | 9830 | |
Ammonium hydroxide | Fluka | 44273 | |
Ammonium persulfate (APS) | AppliChem | A2941 | |
Biofuge pico | Heraeus GmbH | 75003280 | |
Blue R-250 | SERVA Electrophoresis GmbH | 17525 | |
Bromophenol Blue | Pharmacia Biotech | 17132901 | |
C57BL/6J mice | Charles River | ||
Cantharidin | Carl Roth GmbH | 3322.1 | |
Centrifuge tubes for MLS-50 | Beckman Coulter | 344057 | |
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343776 | |
Dithiothreitol (DTT) | AppliChem | A1101 | |
Eppendorf 5417R centrifuge | VWR | 22636138 | |
Eppendorf A-8-11 rotor | VWR | 5407000317 | |
Formic acid | Fluka | 14265 | |
GeneCodis | http://genecodis.cnb.csic.es/ | ||
Gephi | https://gephi.org/ | ||
Glycerol | AppliChem | A1123 | |
Glycine | AppliChem | A1067 | |
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail | Pierce /Thermo Scientific | 78420 | |
HEPES Buffer solution | PAA Laboratories GmbH | S11-001 | |
Homogenization vessel 2 mL | Sartorius AG | 854 2252 | |
Hydrochloric acid | Sigma-Aldrich | H1758 | |
Imidazole | Sigma-Aldrich | I2399 | |
Ingenuity Pathway Analysis | Qiagen | ||
Iodoacetamide (IAA) | Sigma-Aldrich | I1149 | |
Laboratory drilling drive K-ControlTLC 4957 | Kaltenbach & Vogt GmbH | 182997 | |
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2 | Thermo Scientific | ||
LTQ Orbitrap Velos Pro | Thermo Scientific | ||
Macs-mix tube rotator | Miltenyi Biotech | 130-090-753 | |
Magic Scan 4.71 | UMAX | ||
Methanol | Carl Roth GmbH | AE71.2 | |
MLS-50 rotor | Beckman Coulter | 367280 | |
Optima MAX Ultracentrifuge | Beckman Coulter | 364300 | |
PageRuler Prestained Protein Ladder | Thermo Scientific | 26616 | |
PEAKS 7.5 | Bioinformatic Solutions | ||
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3 | Sigma-Aldrich | P0044 | |
PhosphoRS 3.1 | IMP/IMBA/GMI | ||
PhosSTOP | Roche | 4906845001 | |
Plunger/pestle made of PTFE | Sartorius AG | 854 2651 | |
PotterS homogenizer | Sartorius AG | 853 3024 | |
Protease Inhibitor complete mini | Roche | 4693159001 | |
Quantity One 4.5.1 | BioRad | ||
RapiGest | Waters | 186002122 | |
Shuttle box | Coulbourne Instruments | ||
Sodium dodecylsulfate (SDS) | AppliChem | A1112 | |
Sodium molybdate | Carl Roth GmbH | 274.2 | |
Sodium tartrate dihydrate | Sigma-Aldrich | 228729 | |
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath | BANDELIN electronic GmbH & Co. KG | 305 | |
Soundproof chamber | Industrial Acoustics Company | ||
Sucrose | Carl Roth GmbH | 4621.2 | |
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED) | Sigma-Aldrich | T9281 | |
Thermomixer basic | CallMedia | 111000 | |
Titansphere TiO 5µm | GL Sciences Inc. Japan | 502075000 | |
TLA 100.1 rotor | Beckman Coulter | 343840 | |
Trifluoro acetic acid (TFA) | Sigma-Aldrich | T6508 | |
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS) | AppliChem | A1086 | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | T8532 | |
Trypsin Gold | Promega | V5280 | |
Ultimate 3000 Ultra HPLC | Dionex/Thermo Scientific | ||
Ultracentrifuge tube | Beckman Coulter | 343776 | |
Unijet II Refrigerated Aspirator | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge | Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH | ||
Urea | AppliChem | A1049 | |
Water (high quality purifed) | Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C Pyrogens: < 0.02 EU/ml TOC: < 10 ppb | ||
Xcalibur 3.0.63 | Thermo Scientific | ||
ZipTipC18 Pipette Tips | MILLIPORE | ZTC18S960 |