İşitsel Ayrımcılık Öğrenme sonra Fare Beyin Bölgeler Yüksek Çözünürlüklü Sayısal Synaptic Proteome Profil

Summary

The identification of molecules and pathways controlling synaptic plasticity and memory is still a major challenge in neuroscience. Here, a workflow is described addressing the relative quantification of synaptic proteins supposedly involved in the molecular reorganization of synapses during learning and memory consolidation in an auditory learning paradigm.

Abstract

The molecular synaptic mechanisms underlying auditory learning and memory remain largely unknown. Here, the workflow of a proteomic study on auditory discrimination learning in mice is described. In this learning paradigm, mice are trained in a shuttle box Go/NoGo-task to discriminate between rising and falling frequency-modulated tones in order to avoid a mild electric foot-shock. The protocol involves the enrichment of synaptosomes from four brain areas, namely the auditory cortex, frontal cortex, hippocampus, and striatum, at different stages of training. Synaptic protein expression patterns obtained from trained mice are compared to naïve controls using a proteomic approach. To achieve sufficient analytical depth, samples are fractionated in three different ways prior to mass spectrometry, namely 1D SDS-PAGE/in-gel digestion, in-solution digestion and phospho-peptide enrichment.

High-resolution proteomic analysis on a mass spectrometer and label-free quantification are used to examine synaptic protein profiles in phospho-peptide-depleted and phospho-peptide-enriched fractions of synaptosomal protein samples. A commercial software package is utilized to reveal proteins and phospho-peptides with significantly regulated relative synaptic abundance levels (trained/naïve controls). Common and differential regulation modes for the synaptic proteome in the investigated brain regions of mice after training were observed. Subsequently, meta-analyses utilizing several databases are employed to identify underlying cellular functions and biological pathways.

Introduction

Öğrenme bellek izleri ve bunların bakım oluşumu dayanmaktadır. Yaygın bir altta yatan mekanizma nöronlar arasındaki sinaptik mevcut temasların yeni ve / veya yeniden düzenlenmesi bir aktivite bağımlı oluşumunu temsil edebilir olduğu kabul edilmektedir. Moleküler seviyede, çeşitli protein modifikasyonları, hücre içi relocalizations ve sinaptik proteinlerin devir değişiklikler ^1-4 (Lamprecht, 2004 # 8) tarif edilmiştir. Ancak, çoğu şimdiye kadar yapılan çalışmalar oldukça küresel ancak karmaşık sinaptik proteom kompozisyon daha seçilen proteinler üzerinde duruldu. Mevcut yaklaşım öğrenme deneyinde sonra fare beyin bölgelerinde sinaptik proteom değişiklikler için tarafsız bir tarama sağlar. Sinaptik mimarisinin öğrenme kaynaklı yeniden yapılanma zaman noktası bağımlı moleküler anlık işlemek için uygundur. açıklanan iş akışı hayvan davranışları, protein biyokimyası, kütle spektrometresi ve bioi farklı uzmanlar belirli bir ekip çalışması gerektirirnformatics.

Seçilen öğrenme paradigması, yani frekans modüle ton ayrımcılık (FMTD), kemirgenler ⁵ iyi karakterize işitsel ayrımcılık iştir. Bu mekik kutusunun Git / öğrenme ve uzun süreli bellek oluşumu No-Go-görev artmış kortikal dopamin sinyalizasyon ve protein sentezi bağlı mekanizmaları içermektedir. Buna göre, Gerbils ve fareler üzerinde son proteomik çalışmalar, dopamin ve kortikal sinaptik bileşenlerin öğrenme kaynaklı plastik yeniden düzenlemeleri, aynı zamanda sözde FMTD öğrenme ve hafıza ^6-8 sırasında etkileşim daha bazal beyin bölgelerinde ortaya çıkardı. Bu bellek oluşumu, çeşitli beyin bölgelerinde karmaşık bir etkileşim gerektirir ve bu nedenle, farklı şekilde proteom düzeyinde bu bölgeler içinde düzenlenir olabileceğini göstermektedir. Bu nedenle, seçilen kortikal ve subkortikal fare beyin bölgelerinin diseksiyonu iş akışında yer almaktadır.

Ayrıca güvenilir characterizatiHatta sinaptik protein bileşimi zayıf değişiklikler üzerinde öncesi ve postsinaptik bölmeleri bir zenginleştirme yerine homojenatlarında veya ham membran fraksiyonları ⁹ analizini gerektirir. Önceden proteomik analiz nedenle, sinaptozomlarda hazırlanması kurulan kullanılabilme protokolleri tespit seviyesi ve sinaps özgü protein ^10,11 dinamik aralığını artırmak amacıyla tarif edilmektedir.

Nicel amaçlar için etiket ücretsiz yüksek çözünürlüklü kütle spektrometresi kullanmak için önemli bir ön koşul protein örneklerinin yüksek bir benzerlik derecesidir. Olarak sinaptik protein bileşimi oldukça küçük değişiklikler, bir etiket içermeyen bir yaklaşım eğitimli ve naif farelerden elde edilen protein örneklerinin gelen karşılaştırmak uygun olacaktır öğrendikten sonra gerçekleşmesi bekleniyor. Seçenek olarak ise, sabit izotopları (örneğin, TMT, iTRAQ, ICPL ve SILAC) ve MS2 temelli etiket bilgilerini nereye kullanılarak protein / peptid durumu spesifik bir etiket stratejilerintification (SWATH) faydalıdır, ancak seçilen etiket içermeyen bir yaklaşımla daha pahalıdır ya da özel kitle spektrometresi donanım gerekir.

proteomik gösterimleri genellikle karmaşık veri kümelerini verim beri, biyoinformatik işleme uygun veri yorumlanması için tavsiye edilir. Ek meta-analizler paradigma ilgili değişiklikler ve tutulan anahtar hücresel süreçleri ve sinyal yollarının belirlenmesini altında yatan potansiyel moleküler mekanizmaların daha iyi anlaşılmasını destekleyebilir. Uygun yöntemler, aynı zamanda, aşağıda tarif edilmiştir.

Protocol

Hayvan konuları içeren tüm işlemler Alman Federal Kanunu, ilgili AB düzenlemelerine ve NIH kılavuzların yönetmeliklere uygun olarak yapıldı ve Landesverwaltungsamt Sachsen / Anhalt (42502-2-1102 IFN) etik komitesi tarafından onaylanmıştır. 1. İşitsel Öğrenme Mekik kutusunun (FMTD paradigma) Not işitsel ayrımcılık öğrenme: fareler işlerken daima eldiven giyin. şeffaf polikarbonat kafeslerinde serbest gıda pelet erişim ve musluk suyu ile üç veya dört kişilik gruplar halinde Evi C57BL6 / J fareleri. hayvan barınağında karanlık döngüsü: 12 saat ışık koruyun. hayvanlar başka laboratuardan veya bir şirketten alınan Eğer aklimasyonundan en az bir hafta izin ve yerleşme. günde bir mekik kutusu eğitim oturumu gerçekleştirin. hayvan barınağında evde kafes fareyi alın ve ses geçirmez bir bölme içerisinde loş bir mekik kutusuna yerleştirin. işitsel ayrımcılık öğrenme için tam bilgisayar kontrollü öğrenme programı kullanın. sessizlik 3 dakikalık bir alışma dönemi ile başlayın ve daha sonra eğitim oturumu başlatın. yükselen sesi kullanılması dizileri – Go-çalışmalar sırasında Go-uyarıcı olarak (4 ila 8 kHz, CS +): Hayvan (doğru yanıt, hit) ton sunum 6 saniye içinde engel geçmeye vardır. Mekik kutusunun ızgara zemin ile teslim 300 uA, – 50 hafif bir ayak-şok bir bayan cezalandırmak. Hayvan sesi sunum 6 saniye boyunca mekik kutusunun geçerli bölmede kalmalıdır: No-Go-çalışmalar sırasında No-Go-uyarıcı olarak – (4 kHz, CS 8) düşen tonu dizileri kullanın. mekik kutusunun ızgara zemin ile teslim 300 uA, – 50 hafif bir ayak-şok bir yanlış alarm cezalandırmak. 20 5 saniye intertrial aralıkları kullanın. Bir sözde rastgele sırayla seans başına 30 Go-denemeler ve 30 No-Go-denemeler gerçekleştirmek böylece bir sesalgılanması 60 çalışmaların oluşur ve yaklaşık 25 dakika sürer. hayvan barınağında evde kafes içine geri eğitimli hayvan koyun. beyin diseksiyonu Servikal dislokasyon (ilk oturumun tamamlanmasından sonra örneğin 24 saat) kullanılarak eğitim oturumları istenilen sayıdan sonra istenilen zaman noktasında hayvan Euthanize. hayvan başını kesmek. Kes ilk cilt ve sonra sutura sagittalis boyunca düz makas ile kafatası: Hızla şu adımları takip ederek beyin teşrih. Tamamen güçlü forseps kullanarak beyin dokusu kapak kemik parçaları kaldırmak. Bir spattle ile beyin çıkarın. diseksiyon için, buz dolu bir Petri kabı üzerine beyin yerleştirin. işitsel korteks, frontal korteks, striatum ve bir neşter ve iğne kullanılarak bir stereomicroscope altında hipokampus incelemek. Beyin s görsel işaretlerini kullanarak işitsel korteks lokalizekan damarlarının ve yüzey şekli (-3.4 kadar bregmadan -2,06, boyut rostro 2 mm, dorsoventral 1.3 mm) ve bilateral korteks kalınlığı olan bir dikdörtgen doku bloğu olarak incelemek olarak, sert bir. Bir dönüm noktası olarak chiasma Opticum kullanarak ve bulbus olfactorius doku hariç bregma 3.56 ve 1.54 arasında bir beyin dilim olarak frontal korteksi teşrih. Bregma 1.54 ile 0.5 arasında bir beyin dilim olarak striatum incelemek ve dikkatli kortikal doku kaldırmak. beyincik ile iğne ile beyin sabitleme ve oksipital lobda başlayan korteksi uncoiling ile hipokampus teşrih. Şok-dondurularak -80 ° C'de, sıvı azot ve mağaza beyin örnekleri kesilir. 2. Sinaptozomlarda hazırlanması veya Alternatif bir postsinaptik yoğunluklu (PSD) bakımından zenginleştirilmiş Kesir NOT: – 4 ° C Tüm işlemler sırasında, 0 örnekleri ve tamponlar tutmak.Tamponlar, taze proteinlerin proteolitik bozulmasını önlemek amacıyla proteaz inhibitör kokteylleri seyreltildi içerir. Protein fosforilasyonu de incelenmiştir ise, fosfataz inhibitörü kokteyl eklenmesi gerekir. belirtilen tüm g değerleri tüm protokol boyunca g (ortalama) olarak verilmiştir. Kaba membran fraksiyonu, hazırlanması (Şekil 3A) 1 ml buz ihtiva eden bir homojen hale getirme kabı içine Aktarım parçalara beyin dokusu (5 mM HEPES, 320 mM sakaroz, pH 7.4) tampon ve 12 vuruş ile 900 rpm'de doku homojenize soğuk. Santrifüj örnekler 10 dakika boyunca 1000 x g'de. süpernatantlar tutun. Yeniden homojenize 10 dakika için 1000 x g hızında tekrar aynı önce olduğu gibi homojenleştirme, aynı hacimde tampon koşulları ve santrifüj örnekleri pelet. İlgili süpernatantlar birleştirin. özellikle çekirdekleri ve hücre artıkları ihtiva pelet P1, atın. 12,000 x g'da 20 dakika için toplam süpernatantlar dönerler. Sil SupernaDaha fazla fraksiyon 11 tants veya kullanım. 20 dakika boyunca 12.000 x g'de 900 rpm'de ve spin 6 vuruş ile homojenleştirici kullanılarak daha önce olduğu gibi homojenleştirme, aynı hacimde tampon pelet tekrar. Sil süpernatantlar. pelet ham membran fraksiyonları temsil P2. Ham beyin membran fraksiyonlarından sinaptozomlarda saflaştırılması (Şekil 3A) NOT: Ham beyin zarı fraksiyonları miyelin, sukroz yoğunluk adım degrade Ultrasantrifügasyon kullanarak ışık membranlar, sinaptozomlarında ve mitokondri ayrılabilir. Bu 5 mM Tris / HCI, pH için ya 0.32 M, 1.0 M veya 1.2 M konsantrasyonda sukroz içeren 8.1 tampon gerekmektedir. P2 kesirler üretmek için santrifüj yerine getirirken, ultrasantrifüjdeki tüplerinde sakaroz adım geçişlerini hazırlayın. 1.5 ml 1.2 M sükroz tampon bir cam Pasteur pipet kullanarak 2.5 ml 1.0 M sükroz tampon ve alt tabakanın ile başlayın. Yeniden homojenize P2 kesirlergradyanın tepesinde 0.32 M sukroz el 6 vuruş ile tampon ve yükün 0.5 ml. sallanan bir kova rotor kullanarak bir ultrasantrifüjdeki 2 saat boyunca 85.000 xg'de Spin. 1.0 M sükroz tamponu (miyelin, ışık zarlar) arayüz malzemenin dahil olmak üzere üst 0.32 M sükroz tabakası atın. 1.0 / 1.2 M sukroz tamponu arayüzü sinaptozomlar toplayın. Tüpün dibinde pelet mitokondri içerir. 1 oranında 1 saat 150.000 xg'de dikkatli ve spin mix: 1 at sinaptozomal fraksiyona 0.32 M sükroz tamponu ekleyin. Sinaptozomlar pelet olan ve artık daha fazla işlem için gerekli olan bir tampon içinde yeniden süspanse edilebilir. PSD zenginleştirilmiş fraksiyonun hazırlanması (Şekil 3B) 100 ul ekstraksiyon tamponunda tek bir hayvandan alınan her bir belirli beyin bölgesi homojenize (5 mM Tris / HCl, pH 8.1,% 0.5 Triton X-100), bir PTFE (politetrafluoroetilen) havaneli ile 200 ul ultra santrifüj tüpünde12 vuruş ile 2,000 rpm'de. 100 uL ekstraksiyon tamponu ekleyin karıştırın ve 4 ° C sıcaklıkta 1 saat boyunca inkübe edilir. 1 saat 100,000 xg'de Spin ve 200 ul pipet ile dikkatlice süpernatant S1 toplamak. 12 vuruş ile 2,000 rpm'de PTFE havan tokmağı ile tekrar 100 ul ekstraksiyon tamponu ile aynı tüpte pelet P1 yeniden homojenize. 100 ul ekstraksiyon tamponu ekleyin ve 1 saat 100,000 xg'de bir pipet ve spin ile iyice karıştırın. çözünür protein fraksiyonu S1 ile süpernatant S2 birleştirin. Bu fraksiyon sitosolik proteinler,% 0.5 Triton X-100 çözülebilen zar proteinleri ve hücre dışı matris moleküller içerir. 50 ul 5 mM Tris / HCI, pH 8.1 'de kalan pelletini. Bu fraksiyon PSDS, deterjan dayanıklı membranlar, çözünmeyen hücre iskeleti elemanları, mitokondri ve çekirdekleri dahil olmak üzere hücre artıkları içerir. Bu postsinaptik yapıların çekirdeğini oluşturan PİO'lara değil, aynı zamanda presinaptik önemli bölgelerinde zenginleştirilmiştirAktif zonda Cytomatrix. PİO'lara zenginleştirme faktörü yaklaşık 4 ve PSD bileşenlerinin zenginleştirilmesi daha önce ortaya konmuştur. 12 Kütle Spektrometre için 3. Numune Hazırlama Lizis ve örnek normalizasyon NOT: protein konsantrasyonu ile ilgili örnek normalleşme nihayet bile zayıf sinaptik protein ekspresyon değişiklikleri için güvenilir nicel veriler elde etmek çok önemli bir adımdır. (: 5 işitsel korteks için – 15 mg doku kullanım 20 ul malzemenin toplam miktarına bağlı olarak), 8 M üre ve 1 boyunca buz üzerinde inkübe 50 ul – sinaptozomlarda veya 20 bir hayvanın her bir beyin bölgesinden PSD bakımından zenginleştirilmiş preparatlar çözülür ultrasonik banyoda saat. -jel sindirimi için SDS-prova tamponunda doğrudan sinaptozomlar çözülür. Dikkatle jel aşırı yüklenmeyi önlemek için yüklü miktarını hesaplayın. Bu durumda düşünün, yüksek bol iskele protein,ns jel elektroforezi sırasında kaybolan ve jel sindirmek olacaktır. 2 M üre, nihai konsantrasyon sağlamak için çıkarılabilir bir deterjan% 1 seyreltin. Protein Karbamilleme önlemek için 30 ° C'den herhangi bir sıcaklık yüksek kaçının. Standart prosedürlere 13,14 göre bir kısım ile numunenin (örneğin 10 ul), SDS-PAGE gerçekleştirin. Coomassie Blue üreticinin protokolüne uygun olan jel leke. Prosedür, metanol ve asetik asit ile sabitleme ve boyama aşamasını birleştirir. transmisyon modunda kalibre edilmiş bir jel tarayıcı ile bütün şerit her bir numunenin optik yoğunluğunun belirleme ve ilgili bir protein miktarını hesaplayın. Bu hesaplamalara göre örnekleri normalleştirmek. iki farklı bölüme her bir örnek bölün. in-bir çözüm sindirimi için-jel sindirmek için üçte birini ve üçte ikisini kullanın. -Jel sindirimi <strong> Jel ayırma konsantrasyon ayarlanmış örnekleri kullanan ikinci bir SDS-PAGE gerçekleştirin. Leke ve normalizasyon kalitesini kontrol etmek ikinci kez jeller ölçmek. farklı alanlarda (8 / şerit) içinde jel içinde bir numunenin her kulvar kesip ama 170 kDa yukarıda molekül ağırlığı aralığı dışlamak. Ayrı tüplere jel parçalarının aktarın. -jel sindirim etkinliğini kolaylaştırmak için keskin bir bisturi ile daha küçük parçalara alanları (yakl. 1 x 1 mm) kesin. Özet 15 % 50 asetonitril (ACN) ve 50 mM amonyum hidrojen karbonat (NH4 HCO3) 'den oluşan bir tampon 150 ul – birkaç kez 50 ile 10 dakika süre ile (boyama yoğunluğuna bağlı olarak) jel parçalarının yıkayın. süpernatantlar çıkarın. ACN ile jel parçaları örtün ve jel parçaları beyaz olur ve büzülme kadar 20 ° C'de inkübe edin. ACN çıkarın ve 5 için jel parçaları nemlendirir0.1 M NH4 HCO 3. 50 ul dakika ACN aynı hacimde ilave edin ve 37 ° C'de 15 dakika daha inkübe edilir. Çıkarın ve tamamen sıvı atın. bir vakum santrifüjde jel parçalarının kurutun. Sistein artıklarını azaltmak için, 56 ° C'de NH, 45 dakika boyunca, 10 mM ditiyotreitol (DTT) ve ısı örneklerini içeren 4 HCO3 50 ul jel parçalarının rehidrate. Süpernatantlar çıkarın ve indirgenmiş sistein carbamidomethylate için karanlıkta 30 dakika boyunca 55 mM iyodoasetamid (IAA) ihtiva eden 50 ul NH4 HCO3 ekleyin. Çıkarın ve jel parçaları üzerindeki tüm sıvı atılır ve 50 ul HCO3 NH4 ve ACN ile iki kez yıkanır (1: 1), 10 dakika boyunca herhangi bir kalıntı IAA kaldırın. bir vakum santrifüj içinde kuru örnekler. Proteinlerin sınırlı sindirim için 25 mM NH 4 HCO 3 tripsin 12.5 ng / ul içeren ekleyin. gerekli hacim Gel P boyutuna ve miktarına bağlıdırieces. Bir kaç dakika inkübe ve tampon absorbe olup olmadığını kontrol edin. Gerekli jel parçaları tümüyle kaplı olmalıdır eğer daha fazla tampon ekleyin. 37 ° C'de, gece boyunca (dak. 12 saat) inkübe edin. peptit çıkarma 10 ile Yerleşimi jel parçaları – 25 mM NH 4 HCO 3 20 ul ve ACN aynı hacimde ekleyin. ultrasonik banyo kullanılarak buz üzerinde 10 dakika boyunca inkübe edin. Daha sonra kaldırmak ve oluşturulan peptidlerin çoğunu içerir süpernatantlar toplamak. Jel parçaları% 30 ACN /% 0.1 trifloroasetik asit (TFA) ihtiva eden ekstraksiyon tampon 100 ul ekle. ultrasonik banyoda tekrar inkübasyon ve dikkatle bu supernatant toplamak. % 50 ACN konsantrasyonunu artırarak son ekstraksiyon adımları tekrarlayın. ultrasonik banyo 10 dakika sonra aşağı spin ve süpernatantlar toplamak. ekstraksiyon adımlarının her üç karşılık gelen süpernatantlar birleştirin ve bir vakum santrifüjde kurutun. Bunu not etŞerit / numune başına 8 Alanı Bu aşamada yine bir örnek için birleştirilmiştir jel ayırması sonucu. Gelen çözeltisi sindirimi özet Hesaplanan miktarda kullanmak için en az üç teknik çoğaltır için yeterli başlangıç malzemesinin elde edilmesi için normalize numunelerin (örneğin, bir 150 ul lizat, 100 ul, belirli bir beyin bölgesinde bir numunenin yeniden süspanse edilmesi için gerekli malzeme miktarı ve hacmine bağlıdır) etiket ücretsiz kütle spektrometresi gerçekleştirin. 25 mM NH 4 HCO 3 2 mM DTT ekleyin ve hafifçe örnek vorteks. 20 ° C 'de 45 dakika süre ile numuneler azaltır. sistein artıklarını carbamidomethylate 10 mM IAA ekleyin. Karıştırın ve 20 ° C'de karanlıkta 30 dakika boyunca inkübe edin. Son olarak, (25 mM asetik asit içinde 1 mg / ml tripsin), bir tripsin stok çözeltisi 1 ul 12 saat süre ile 20 ° C'de inkübe edin. Katı-faz ekstraksiyonu (SPE) arıtmasından asit bölünebilir Deterjanı ortadan kaldırmak için% 1 TFA nihai konsantrasyona kadar örnekleri ayarlayın ve 20 ° C'de 1 saat boyunca inkübe edilir. Santrifüj örnekler 10 dakika boyunca 16.000 x g'de ve dikkatli bir şekilde süpernatantlar toplamak. rafa SPE sütunu yerleştirin ve 2 ml metanol ile matris dengelenmesi. su içinde% 0.1 TFA, 2 ml (tampon B) ile iki kez yıkanır. tampon B 2 ml ekleyin ve örnek yüklemek. Başka üç kez yıkayın. 200 ul% 70 ACN /% 0.1 TFA eklenerek peptitlerin yıkanması. bu adımı yineleyin. Her iki eluatları havuz ve vakumlu bir santrifüjde aşağı kurutun. TiO2 kromatografi 16 tarafından fosfo-peptid-zenginleştirme 50 'TiO2 boncuk 2 ~% 80 ACN /% 2.5 TFA (tampon C) 150 ul sindirmek ve dengeye jel içi veya çözeltisi mg biri tarafından üretilen peptidlerin çözülürTampon C ul 20 ° C'de 1 saat boyunca döner bir cihazın numune boncuk ekleyin ve inkübe edilir. Daha sonra, spin aşağı boncuk (16,000 xg, 1 dk) ve süpernatantlar toplamak. yavaşça, karıştırma ve 5 dakika sonra aşağı iplik boncuk tampon C, 100 ul ile üç kez yıkayın. süpernatantlar toplayın. sırasıyla (ACN olmadan)% 0.1 TFA, 100 ul ile üç kez yıkanması izler% 80 ACN /% 0.1 TFA, 100 ul, bu adım, üç kez tekrarlayın. Her on süpernatantlar birleştirin vakumlu bir santrifüjde Kurutun ve adım 3.5 olarak daha fazla arıtma için, fosfo-peptid-tükenmiş fraksiyonu olarak ele. Boncuklardan 400mM NH4OH /% 30 ACN 20 ul ile bağlanmış fosfo-Peptidlerin elüsyonu. Bu adımı üç kez tekrarlayın ve boncuk aşağı iplik sonra tüm süpernatantlar toplamak. -Jel sindirimi ve eluatları birleştirin ve bir örnek olarak çözeltisi sindirimi ve fosfo-p olarak elefraksiyonu eptide zenginleştirilmiş. 8 ul – 4 nihai bir hacme kadar vakumlu bir santrifüjde kurutun. Konsantre ve mikro-SPE tarafından fosfo-peptid tükenmiş fraksiyonların tuzsuzlaştırma % 0.1 TFA 20 ul içinde kurutulmuştur peptidler çözülür. Ucu içine ACN'yi 20 ul çizerek sabit C 18 -Matris dengelenmesi. ucu içine su içinde% 0.1 TFA çizerek matrisi yıkayın. işlemini üç kez tekrarlayın. Yavaş yavaş ucu içine asitlendirilmiş örnek yüklemek (Bu adımı üç kez tekrarlayın). Su içinde 20 ul% 0.1 TFA C18 -Matris üç kez yıkayın ve yıkama solüsyonu atın. art arda (3 kez) TFA% 70 ACN 20 ul / 0.1% çizerek pipet ile ilgili peptitlerin yıkanması ve ayrı bir tüp içinde, bu elüsyon çözeltisi toplar. Bir numunenin eluatları birleştirin ve vakumlu bir santrifüjde kurutun. 4. Proteome Analizi <p> NOT: Proteome analizi ultra HPLC ile teçhiz edilmiş bir hibrid çift basınçlı lineer iyon tuzağı / Orbitrap kütle spektrometresi üzerinde gerçekleştirilir. HPLC 20 ul enjeksiyon döngü ile soğutulmuş otomatik örnekleyici oluşur, bir ikili yükleme pompası (ul akış aralığı), bir ikili nano akış ayırma pompa, valf ve bir gaz giderici anahtarlama iki mikro bir sütun ısıtıcı. Numuneler ilk olarak 250 NL / dakikada bir sütun (örneğin, 75 mm x 25 cm) üzerinde ayırma, ardından 7 ml / dk bir akış oranında bir tutma kolonu (örneğin 100 mm x 2 cm) tabi tutulur. Ayırma kolonu çıkışı doğrudan kütle spektrometresi iyonizasyon kaynağı bir nano sprey arayüzünde yer alan bir kaplanmış Pico yayıcı ucuna birleştirilir. Nano-sıvı kromatografi ve tandem kütle spektrometresi En az 30 dakika boyunca 12 ul% 2 ACN /% 0.1 TFA içinde peptid örnekleri çözülür. 15 saniye aşağı Spin ve şişeleri (konik, azaltılmış Diamete autosampler 11 ul süpernatant transferir). Aşağıdaki gibi kontrol yazılımı (örneğin, Xcalibur) de örnek uygulama, kromatografik ayırma ve tandem kütle spektrometresi için otomatik rejimi kurmak. Otomatikörnekleyici'den: Sıcaklık aşağıdaki kullanın 5 ° C; Kolon Fırını: 45 ° C. Hacim: Enjeksiyon için aşağıdaki kullanın 10 ul; akış hızı: 7 ml / dk (% 2 ACN,% 0.1 TFA); Süresi: 8 dakika; Vana ayarı: tuzak sütun – atıkları; kütle spektrumu edinimi: kapatır. Akış hızı: 250 nl / dak Vana ayarı: Ayrılık için aşağıdakileri kullanın tuzak sütun ayırma kolonu; kütle spektrumu edinimi: on. 0 dakika – 100 dakika:% 2 ACN,% 0.1 formik asit -% 40 ACN,% 0.1 formik asit 100 dakika – 105 dakika:% 40 ACN,% 0.1 formik asit -% 95 ACN,% 0.1 formik asit 105 dakika – 109 dakika:% 95 ACN,% 0.1 formik asit 109 dakika – 120 dakika:% 2 ACN,% 0.1 formik asit Tam MS: Ftms; kütle spektrometresi ayarları için aşağıdaki kullanın çözünürlüğü 60.000; m / z aralığı 400 – 2000; BAYAN/MS: Doğrusal Iontrap; minimum sinyal eşiği 500; yalıtım genişliği 2 Da; 30 saniye ayarı dinamik dışlama süresi; tek başına-yüklü iyonlar seçimden çıkarılır; normalize çarpışma enerjisi 10 milisaniye zaman% 35'e ayarlayın ve aktivasyon edilir. NOT: Tam MS taraması en bol tespit peptid iyonlarının çarpışması kaynaklı-ayrışma (CID) kullanarak çalışır kadar 15 LTQ MS / MS tarafından takip edilmektedir. Tüm numuneler için üç teknik çoğaltır çalıştırın. Protein tanımlama ve etiket ücretsiz ölçümü Protein tanımlama ve etiket içermeyen kantitatif (örneğin, PEAKS Studio'yu) ticari bir yazılım paketi kullanarak doğru süreç kitle spektrometresi ham veriler. Diğer çoğu proteom yazılım paketleri aksine bu özel yazılım kullanan bir de novo -sequencing algoritması protein veritabanı hizalamaları önce. Bununla birlikte, bu adım kolayca diğer popüler yazılım paketleri tarafından ikame edilmiş olabilir. Kullanım essTablo 2'de listelenen ential ayarlar. Fosfo-proteomiks NOT: Verimli ve güvenilir fosfo-peptid edinme proteomik iş akışı kurulum birkaç temel değişiklikler gerektirir. fosfo-peptid zenginleştirme sonra, asla kuru numuneler tamamen. Her zaman çözülmüş örnekleri tutmak. NOT: fosforile treonin veya serinler yerine fosfo-ester bağı çok kırılgan olduğunu. Bu fosfat nötr kaybı ile sonuçlanan iyon tuzağı içinde çarpışma bağlı parçalanma sırasında. Bu da tanımlanması için gerekli olan peptid, herhangi bir daha fazla parçalanma önler. Kütle spektrometresi kurulumunda izin verilen geniş bant-aktivasyon bile fosfat grubunun nötr kaybından sonra fosfo-peptidler parçalanma sağlar. Bir zaman "sözde-MS 3" tasarruf yapar. MS / MS verilerinde fosfo site belirleme, belirli bir doğrulama ve değerlendirme gerektirir ve Fosforlar 3 yapılabilir.0. 5. Biyoinformatik – Meta-Analiz NOT: Fonksiyonel ek açıklama ve ağ analizi yapmadan önce, protein listeleri Önişlenmiş gerekir. İlk ayrı ayrı beyin bölgesi için düzenlenen proteinler ve fosfo-peptidler listelerini birleştirme. Daha sonra da bütün yanlış yorumlamaları önlemek için her fraksiyon için UniProt-kimliklerini yinelenen kaldırın. GeneCodis 17, tekil zenginleştirme analizi GeneCodis web tabanlı aracını açın (http://genecodis.cnb.csic.es) ek açıklama olarak "Biyolojik Süreci GO" organizma olarak "Mus musculus" seçin ve. Belirli bir fraksiyonun UniProt-kimliklerinin bir listesini yapıştırın. Gönder ve analizi yapılır kadar bekleyin. "GO Biyolojik Sürecinin Tekil Zenginleştirme Analizi" üzerine tıklayın ve sonuçları görüntülemek. Diğer üç kesirler için yineleyin 5.1.3. Sonuç listeleri arasında herhangi bir tekrarları ve kavşakları görmek içingerekli verileri filtrelemek için Perl veya Python gibi bir komut dosyası dili kullanın. tekil bir zenginleştirme analizi için benzer araçlar PlugIns bingo (http://apps.cytoscape.org/ ile DAVID (https://david.ncifcrf.gov/) ve Cytoscape (http://www.cytoscape.org/) vardır uygulamalar / bingo) ve ClueGO (http://apps.cytoscape.org/apps/cluego). Gephi ile GeneCodis verilerinin dışında bir kuvvet tabanlı grafik oluşturuluyor (https://gephi.org/) Not: grafikler için veriler grafik formatında (.gexf, .graphml, dot, .gv, .gml) ya da el ile girilen ya kullanıcı tarafından sağlanmalıdır. Grafik düğümleri oluşturuluyor El ile: ve Açık Gephi "Veri Laboratuvarı" üzerine tıklayın. düğümleri oluşturun. "Düğümler" masaya geçmek için soldaki "Düğümler" linkine tıklayın. "Düğüm Ekle" üzerine tıklayın. Dönem adını girin. "Tamam" ı / Enter tuşuna basın. Alternatif: Kaydet GeneCodis PC'ye sonuçlanır. Bir elektronik tablo programı ile .txt açın. tüm satırlar exce sil"Item_Details" (terim isimleri) dan pt. Değişim başlığı "Label" için "Item_Details". ".csv" Olarak Elektronik Tablo kaydedin. Şimdi Gephi içinde, "İthalat elektronik tablodaki" üzerine tıklayın. Gephi dosya tarayıcısı-tabloyu seçin. "İleri" ye tıklayın. "Finish" düğmesine tıklayın. kenarları yoluyla düğümleri bağlayan. "Kenarları" masaya geçmek için soldaki "Kenarlar" linkine tıklayın. Her düğüm (Dönem) için: Diğer Şartlar gen isimleri bakın. Bir veya daha fazla gen paylaşılıyorsa -> kenar oluşturun. "Kenar Ekle" üzerine tıklayın. "Yönsüz" seçeneğini seçin. Kaynak seç ve açılan listeleri dışında hedef düğüm. "Tamam" ı / Enter tuşuna basın. Birden fazla genin paylaşılıyorsa, "Ağırlık" (tablo) bolluk girin. Kuvvet grafik düzeni tabanlı. elle girilen Açık grafik veri dosyası, grafik tipini "yönsüz" veya verileri kullanmak set zaten selecte değilse "Genel Bakış" üzerine tıklayınd. bağlantıların bolluk bağlı düğümleri yeniden boyutlandırma. İstatistik tıklayın "Ağ Genel Bakış" başlığı altında "Ortalama Diploması" (ağırlıksız kenarlar) ya da "Ort. Ağırlıklı Diploması" (ağırlıklı kenarlar) ya çalıştırın. "Görünüm" in, "Özellikler" i seçin sonraki Boyut Düğmesine sonra, "Düğümler" üzerine tıklayın ve Nitelikler parametresini "Ort. Ağırlıklı Derece" ya da "Ortalama Derece" olarak ayarlayın. Uygula'yı tıklayın. Nihayet: "Düzen" in "Kuvvet Atlas" ı seçin ve çalıştırın; düğümleri çarpışan eğer "Tiksinti gücü" olarak değiştirin. Resme ihracat. Ekran özelliği: "Genel Bakış", değişim grafik düzeni, kenar kalınlığı, etiket boyutu ve "Grafik" penceresinin altındaki menü ile ölçekleme tıklayın. Kamera sol düğmesini tıklayın ve resmi kaydedin. "Önizleme" İhracat özelliği: "Önizleme" tıklayın. "Düz Varsayılan" için Presets değiştirin. Ayarları değiştirs seçilen tercihleri ​​doğrultusunda ve ihracat "SVG / PDF / PNG" üzerine tıklayın.

Representative Results

Şekil 1 işitsel ayrımcılık öğrendikten sonra fare beyin bölgelerinde kantitatif sinaptik proteom profil tam iş akışı özetlenmektedir. Bir mekik kutusunun hayvan eğitimi ile başlar. Şekil 2'de gösterilen örnekte, farenin etkin öğrenme gösteren, 4. antrenman önemli FM sesi ayrımı göstermeye başladı. Hayvanlar beyin bölgesi diseksiyon için seçilen zaman noktalarında kurban edilmiştir. Sinaps gerekli zenginleştirilmesi ya sinaptozomlarda hazırlanması ile elde edilebilir ya PSD zenginleştirme yöntem şöyle ki düşük doku miktarları için geliştirilmiştir alternatif olarak bir PSD zenginleştirilmiş fraksiyonun hazırlanması, her iki Şekil 3'te detaylı olarak tarif, örneğin, 1 – sıçan beyninde 12, 18 2 hipokampal dilim. Küçük tüpler, bu tüplere uydurma PTFE havan ve havan tokmağı güç sağlamak için bir laboratuvar delme sürücü gerektirir. Nedeniyle Sinaptozomlarda özel bir protein bileşimine, kuvvetle iki farklı fakat birbirini tamamlayıcı şekilde numune hazırlama gerçekleştirmek için tavsiye edilir. PİO'lara iskeleleri genellikle yüksek stoikiometride meydana gelen, çok yüksek moleküler ağırlıklı proteinler bulunmaktadır. In-çözelti sindirimi verimli onları ayıklamak için ancak üretilen peptid karışımı bir oversampling yol açabilir en iyi yoldur. -jel, bu yüksek molekül ağırlıklı proteinler dahil, orta ve düşük molekül ağırlığına sahip proteinlerin analizi destekleyebilir paralel aynı örnek gerçekleştirilir sindiremez. Kapsamlı bir analiz için proteolitik sindirimi her iki tip tavsiye edilir. olan beyin alanlarında dokuların farklı miktarlarda iyi karşılaştırma için uygulanan malzemeden bir ayarlanmalıdır. Dört incelenen beyin alanları içerisinde işitsel korteks genellikle sınırlayıcı bir gerçektirveya. Diğer tüm beyin alanlarının malzeme dikkatlice sinaptozomlarında veya PSD zenginleştirilmiş fraksiyonların hazırlandıktan sonra işitsel korteks miktarına göre ayarlanmalıdır (3.1.1 bkz.). şu şekilde farelerden taze hazırlanmış beyin alanlarının tipik ağırlıkları: işitsel korteks (AC): ~ 50 mg; hipokampus (HIP): ~ 90 mg; striatum (STR): ~ 120 mg ve frontal korteks (FC): ~ 100 mg. Bölüm 2.3'te tarif edilen PSD zenginleştirme yöntemi yaklaşık 1500 farklı protein ve tek bir hayvana (Tablo 1) düzeyinde beyin bölgesi başına yaklaşık 250 farklı fosfo-peptidlerin tanımlanmasına izin verdi. 24 saat ilk antrenmandan sonra proteomik analizi tespit proteinlerin% 7.3 ve fosfo-peptidlerin% 5.8 anlamlı (p <0.05) naif kontrollerle (Tablo 1) ile karşılaştırıldığında onların sinaptik ifade kantitatif değişiklikler gösterdi olduğunu ortaya koydu. aşağı termostatın için göze çarpan eğilimsinaptik iskelelerinin yon FMTD öğrenme erken dönemlerinde sinaptik mimarisi belirgin yeniden düzenlenmesi işaret edebilir. Sadece% 22, iki ya da daha fazla beyin bölgelerinde düzenlenir bulunmuştur ise düzenlenmiş proteinlerin büyük bir kısmı, bir beyin bölgesi özel bir şekilde değiştirildi. Altı Seçilen örnekler Şekil 4'te gösterilmiştir. "RhoA Sinyal", "Notch Sinyal" Klatrin aracılı endositoz Sinyal "," aksonal Rehberlik Sinyal "," Kalsiyum Sinyali: "IPA karmaşık sonuçların meta-analizi aşağıdaki kanonik yolların belirli katılımı / manipülasyon için kanıt sağlar "," Epitel adherens Eklemlerinin Yaptırma "," Glutamat Reseptör Sinyalizasyon "," GABA Reseptör Sinyalizasyon "," Dopamin Reseptör Sinyalizasyon "ve" Synaptic Uzun Vadeli potansiyelize ". <p class="jove_content" fo:keep-together.withsayfa = "1"> Tek zenginleştirme analizi protein taşıma, hücre yapışması, fosforilasyon, endositoz, vezikül aracılı taşıma, ön beyin gelişimi ve axonogenesis (Şekil 5) ile ilgili frontal korteks önemli yoğunlaştığından biyolojik süreçleri ortaya çıkardı. iyon taşıma, çeviri, mRNA taşıma dahil olmak üzere işitsel korteks biyolojik süreçlerde protein taşıma ve öğrenme fark vardı. hipokampus protein fraksiyonunun analizi anlamlı iyon taşıma, hücre döngüsü, çeviri, fosforilasyon ve sinir sistemi gelişimi ile ilgili zenginleştirilmiş süreçleri algılar. striatum mRNA nakliye, vezikül aracılı taşıma, axonogenesis, proteoliz, protein taşınmasına ve endositoz dahil olmak üzere biyolojik işlemler bulunmuştur aşırı temsil. Şekil 1: Sistematik WorkfloMetodolojik Yaklaşım w. Bu rakam şematik beyin alana özgü sinaptik protein bileşiminin yüksek çözünürlüklü sayısal profilleme iş akışını özetlemektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 2: FM Ton Ayrımcılık Görev içinde Fare Performans örneği. Hayvanlar hit artan oranı (mavi eğri) ve eğitim oturumları sırasında yanlış alarm azalan oranı (siyah eğri) gösterir. Önemli ayrımcılık dördüncü oturumda gerçekleşir. Hata çubukları SEM olarak verilmiştir. Bir LAR görmek için buraya tıklayınızBu rakamın ger sürümü. Şekil 3: sinaptozom ve PSD zenginleştirilmiş Kesir hazırlanması. C: sinaptozom hazırlanması. B: PSD zenginleştirilmiş fraksiyon hazırlanması. Her iki rakamlar beyin dokularından sinaptozomlarında veya alternatif PSD zenginleştirilmiş fraksiyonların hazırlanması detaylı iş akışını açıklar. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 4: Seçilen Kantitatif proteomik Sonuçları. Seçilen proteinlerinin nispi sinaptik bolluğu farenin tra arasında karşılaştırıldı(AV n = 6) FMTD görev ve naif kontrol fareleri (NV, n = 6) 24 saat sonra ilk eğitim oturumu çağırın. bolluğu değerleri proteininin üç en yoğun peptidlerin pik alanlarının ortalaması olarak hesaplanmıştır. önemli bolluk değişiklikleri (AV / NV; t-testi) ile Proteinler araziler içinde işaretlenmiştir: * p <0.05, ** p <0.01, *** p <0.005. Hata çubukları SD olarak verilmektedir. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. Şekil 5: GeneCodis / Gephi tarafından Frontal Cortex Biyolojik Pathways Görselleştirme. Üç minimum protein sayısı ile "Biyolojik süreci" ile ilgili Gen Ontoloji (GO) veritabanı (http://geneontology.org) tek önemli terimler burada gösterilmektedir. Düğümler GO terimleri temsil düğümün büyüklüğü, belirli bir düğümün bağlantı çizgi genişliği ve sayı diğer düğümlerle bu GO terimi paylaşan proteinlerin sayısını tasvir. Nedeniyle Gephi ve "Kuvvet Atlası" yöntemine, ilgili düğümleri birlikte yakından kümeleme vardır. Bu rakamın büyük halini görmek için lütfen buraya tıklayınız. beyin bölgesi AC FC KALÇA 000 "face =" Calibri "size =" 3 "> STR Σ tanımlanan proteinler 1435 1758 1572 1507 6272 düzenlenmiş proteinler (p <0.05) 59 130 162 108 face = "Calibri" size = "3"> 459 ↑ AV / NV 8 4 76 35 123 ↓ AV / NV 51 126 86 73 336 tespit phosphomoti fs 197 361 273 278 1109 düzenlenmiş phosphomotifs (p <0.05) 8 22 21 14 65 ↑ AV / NV 4 00000 "face =" Calibri "size =" 3 "> 17 5 9 35 ↓ AV / NV 4 5 16 5 30 Tablo 1: Proteomik Sonuç Özeti. Bu tablo eğitimli fareler temsilcisi proteomik deneyi özetler (AV n = 6) kendi saf kontrollerle karşılaştırıldığında ilk antrenmandan sonra 24 saat (NV, n = 6).459 düzenlenmiş proteinlerin toplamı örtüşen düzenlemeler içermektedir. 283 farklı düzenlemeler beyin özgü olarak belirlendi. Ayrıntılı olarak, 57 proteinler iki beyin bölgelerinde düzenlenir, 18 protein düzenlemeleri üç beyin bölgelerinde tespit edildi ve sadece 2 proteinler dört incelenen beyin bölgelerinde düzenlenir. Hata toleransı haberci kütlesi (Fourier dönüşüm kütle spektrometresi) 10 ppm fragmanı iyon kütle (lineer iyon tuzağı) 0.6 Da Peptid başına maksimum cevapsız bölünmeler 3 sabit değişiklikler in-jel sindirilmiş numuneler Sistein karbamido ile ilgili olarak numunelerde çözeltisi sindirilmiş MethylthiolatioSistein n değişken modifikasyonlar Metionin oksidasyonu Asparagin ve / veya Glutamin Deamidations veritabanı Unıprot / Sprot Taksonomi fare İstatistiksel tanımlama-kabul ayarları de novo ortalama yerel güven (ALC) >% 50 Peptit-yanlış keşif oranı (FDR, est dayalı. Tuzak-füzyon) <% 1 Protein önemi (-10logP, modifiye T-testine göre) > 20 özgü peptidler / protein ≥ 1 Niceleme ayarları: ölçümü durumunda kullanılan peptitler: Peptit önemi (-10logP) > 30 Peptid kimliği Numunelerin ≥% 50 Peptit sinyal kalitesi > 1 Peptit ortalama alan > 1E5 Peptit tutma süresi tolerans <5 4.2.2).

Discussion

Çalışma, öğrenme ve farelerin farklı beyin bölgelerinde bellek konsolidasyon sırasında sinaptik protein ekspresyon değişiklikleri doğru bir kantitatif profil için optimize edilmiş bir metodolojik iş akışı sunuyor. Kurulum kütle spektrometrik analizi için numune başına en az üç teknik çoğaltır gerekli uygulama rağmen tek hayvanın düzeyde protein ifadesini incelemek için bir fırsat sağlar.

metodoloji dikkate yüksek molekül ağırlıklı iskele proteinlerinden oluşan öncesi ve postsynapse özel protein bileşimi alır ama aynı zamanda orta ve düşük molekül ağırlıkları taşıyan önemli bir aracı proteinlerin. sinaptozomal preparasyonlar arasında çözeltisi dijestleri etkin üretimi ile sonuçlanabilir ve bu nedenle, skafold türetilen peptidlerin aşırı gösterimi. Bu durum, daha küçük ya da daha düşük fazla proteinler analizi baskılayabilir. Bir gelen SDS-PAGE fraksiyonların önerilen hazırlanmasıparalel bir in-jel sindirim işlemi ile kombine her numunenin kısım orta ve düşük bolluk proteinlerin analizi kolaylaştırır ve bir tavsiye tamamlayıcı bir yöntem temsil eder. Numuneden türetilen tüm fraksiyonlar ayrı kitle spektrometrik uygulamasından sonra (içi çözelti, sindirimi örn jel birleştirildi fosfo-zengin fraksiyonlar, özet) karşılık gelen, MS / MS verileri birleştirilmiş ve daha fazla zirvelere protein tespit edilmek ve nicelendirilmek üzere hesaplanabilir yazılım veya alternatif popüler yazılım paketleri.

Seçenek olarak ise, in-çözeltisi ile sindirilmiş numunenin üretilen-jel-sindirim-türetilmiş bir örnek fraksiyon (örnek şerit ayrı ayrı işlenmiş jel alanları) ve kısımların her birinin ayrı bir artırabilir kütle spektrometrisine (iyon değişim kromatografisi ile) analitik derinliği. Ancak, bu genişletilmiş iş akışı önemli ölçüde LS-MS / MS veri toplama için gerekli süreyi artırır. Generatio içinproteomik profil belirli bir zaman sürecini öğrenme ve hafıza oluşumu sırasında sinaptik proteinin yeniden düzenleme ayrıntılı bir molekül dizisinin N gereklidir. Hayvanların performans yakl öğrenme eğrisi asimptotik seviyesine ulaşana kadar bu sefer ders sonra veya hatta ilk antrenman sırasında hemen başlaması ve yakın örgülü zaman çerçevesi kapsar olabilir. 8 – Eğitimin 10 gün (ayrıntılar için bakınız Şekil 2).

sinaptik proteinlerin fosforilasyon değişiklikleri analiz FMTD öğrenme sırasında seçilen zaman dilimlerinde belirli bir odak gerektirir. Protein fosforilasyon ve dephosphorylations tetiklediği bilinen sinaptik protein düzenlenmeleri başlatarak bir yandan sinyal iletim hayvan eğitimi çok erken aşamalarında bekleniyor. Öte yandan, S olan bağlantı ve montaj düzenleyen bilinen çok fosforile sinaptik proteinlerin uzun süreli değişiklikler vardırynaptic mimarisi ^{19, 20.} Bu posttranslasyonel değişiklikler bile hafıza konsolidasyon sonraki zaman noktalarında bekleniyor.

Bu proteomik iş akışı tarafından oluşturulan karmaşık veri setleri moleküler yollar ve anahtar molekülleri katılan tanımlamak için biyoinformatik işlem gerektirir. Meta-analizi, öğrenme ve hafıza süreçlerinde rol oynayan önemli bir yoğunlaştığından yolları göstermektedir.

Materials

3M Empore Solid Phase Extraction- Filter	3M Bioanalytical Technologies	4245SD	7 mm/3 ml
Acclaim PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164564	100 µm x 2 cm, C18
Acclaim PepMap 100	Dionex/Thermo Scientific	164569	75 µm x 25 cm, C18
Acetic acid	Carl Roth GmbH	3738.1
Acetonitrile (ACN)	Carl Roth GmbH	AE70.2
Acrylamide (30%)	AppliChem	A0951
Ammonium hydrogen carbonate	Fluka	9830
Ammonium hydroxide	Fluka	44273
Ammonium persulfate  (APS)	AppliChem	A2941
Biofuge pico	Heraeus GmbH	75003280
Blue R-250	SERVA Electrophoresis GmbH	17525
Bromophenol Blue	Pharmacia Biotech	17132901
C57BL/6J mice	Charles River
Cantharidin	Carl Roth GmbH	3322.1
Centrifuge tubes for MLS-50	Beckman Coulter	344057
Centrifuge tubes for TLA 100.1 rotor	Beckman Coulter	343776
Dithiothreitol (DTT)	AppliChem	A1101
Eppendorf 5417R centrifuge	VWR	22636138
Eppendorf A-8-11 rotor	VWR	5407000317
Formic acid	Fluka	14265
GeneCodis	http://genecodis.cnb.csic.es/
Gephi	https://gephi.org/
Glycerol	AppliChem	A1123
Glycine	AppliChem	A1067
HALT Phosphatase Inhibitor Cocktail	Pierce /Thermo Scientific	78420
HEPES Buffer solution	PAA Laboratories GmbH	S11-001
Homogenization vessel 2 mL	Sartorius AG	854 2252
Hydrochloric acid	Sigma-Aldrich	H1758
Imidazole	Sigma-Aldrich	I2399
Ingenuity Pathway Analysis	Qiagen
Iodoacetamide (IAA)	Sigma-Aldrich	I1149
Laboratory drilling drive  K-ControlTLC 4957	Kaltenbach & Vogt GmbH	182997
LTQ Tune Plus 2.7.0.1112 SP2	Thermo Scientific
LTQ Orbitrap Velos Pro	Thermo Scientific
Macs-mix tube rotator	Miltenyi Biotech	130-090-753
Magic Scan 4.71	UMAX
Methanol	Carl Roth GmbH	AE71.2
MLS-50 rotor	Beckman Coulter	367280
Optima MAX Ultracentrifuge	Beckman Coulter	364300
PageRuler Prestained Protein Ladder	Thermo Scientific	26616
PEAKS 7.5	Bioinformatic Solutions
Phosphatase Inhibitor Cocktail 3	Sigma-Aldrich	P0044
PhosphoRS 3.1	IMP/IMBA/GMI
PhosSTOP	Roche	4906845001
Plunger/pestle made of PTFE	Sartorius AG	854 2651
PotterS homogenizer	Sartorius AG	853 3024
Protease Inhibitor complete mini	Roche	4693159001
Quantity One 4.5.1	BioRad
RapiGest	Waters	186002122
Shuttle box	Coulbourne Instruments
Sodium dodecylsulfate (SDS)	AppliChem	A1112
Sodium molybdate	Carl Roth GmbH	274.2
Sodium tartrate dihydrate	Sigma-Aldrich	228729
SONOREX RK 156 Ultrasonic Bath	BANDELIN electronic GmbH & Co. KG	305
Soundproof chamber	Industrial Acoustics Company
Sucrose	Carl Roth GmbH	4621.2
Tetramethyl ethylene -1,2-diamine (TEMED)	Sigma-Aldrich	T9281
Thermomixer basic	CallMedia	111000
Titansphere TiO 5µm	GL Sciences Inc. Japan	502075000
TLA 100.1 rotor	Beckman Coulter	343840
Trifluoro acetic acid  (TFA)	Sigma-Aldrich	T6508
Tris ( hydroxymethyl) aminomethane (TRIS)	AppliChem	A1086
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8532
Trypsin Gold	Promega	V5280
Ultimate 3000 Ultra HPLC	Dionex/Thermo Scientific
Ultracentrifuge tube	Beckman Coulter	343776
Unijet II Refrigerated Aspirator	Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
UNIVAPO 100 H Concentrator Centrifuge	Uniequip Laborgeräte- und Vertriebs GmbH
Urea	AppliChem	A1049
Water (high quality purifed)			Resistivity: > 18.2 MΩ*cm at 25 °C  Pyrogens: < 0.02 EU/ml                TOC: < 10 ppb
Xcalibur 3.0.63	Thermo Scientific
ZipTipC18 Pipette Tips	MILLIPORE	ZTC18S960