Экспериментальный протокол для обнаружения<em> Цианобактерии</em> В жидких и твердых образцах с антителом Microarray Chip
Summary
The presence of cyanobacterial toxins in fresh water reservoirs for human consumption is a major concern for water management authorities. To evaluate the risk of water contamination, this article describes an protocol for the in-field detection of cyanobacterial strains in liquid and solid samples by using an antibody microarray chip.
Abstract
Глобальное потепление и эвтрофикации сделать некоторые водные экосистемы ведут себя как истинные биореакторы, которые вызывают быстрое и массовый рост цианобактерий; это имеет соответствующие медицинские и экономические последствия. Многие штаммы цианобактерий производители токсин, и лишь немногие клетки необходимы, чтобы вызвать непоправимый ущерб окружающей среде. Поэтому, водоеме власти и управления необходимы системы быстрого и эффективного раннего предупреждения, обеспечивающих надежные данные для поддержки их профилактического или лечебного решения. Эта рукопись сообщает экспериментальный протокол для обнаружения в полевых штаммов цианобактерий токсин-продуцирующих с использованием микрочипов чип антитела с 17 антителами (ABS) с таксономическим разрешением (CYANOCHIP). Здесь мультиплекс флуоресцентный сэндвич микрочипов иммуноферментного анализа (FSMI) для одновременного мониторинга 17 штаммов цианобактерий часто встречаются цветущие в пресноводных экосистемах, некоторые из них производители токсин, описан. Микрочипа с несколькимиPLE идентичные дублированные (до 24) CYANOCHIP была напечатана на одном предметном стекле микроскопа одновременно испытать такое же количество образцов. Жидкие образцы могут быть испытаны либо путем непосредственного инкубации с антителами (абс) или после того, как концентрации клеток с помощью фильтрации через фильтр с диаметром от 1 до 3 мкм. Твердые образцы, такие как осадков и грунтовых пород, сначала гомогенизируют и диспергируют с помощью ручного ультразвукового дезинтегратора в инкубационном буфере. Они затем фильтруют (5 – 20 мкм) для удаления крупнозернистого материала, и фильтрат инкубируют с Абс. Immunoreactions выявлены окончательной инкубации со смесью 17 флуоресцентно-меченного Абс и считываются с помощью портативного флуоресцентным детектором. Весь этот процесс занимает около 3 ч, большинство из них, соответствующих двум 1-х периодов инкубации. Выходной сигнал представляет собой изображение, где яркие пятна соответствуют положительному обнаружения цианобактерий маркеров.
Introduction
Обнаружение и мониторинг микроорганизмов в сложных природных микробных сообществ играют решающую роль во многих областях, в том числе биомедицины, экологии окружающей среды, и астробиологии. Цианобактерии являются прокариотические микроорганизмы хорошо известны своей способностью образовывать водорослей (избыточное разрастание) клеток в пресной воде. Они повсеместно распространены, и многие виды способны производить токсины, что приводит не только к потенциальному риску для здоровья человека, но и к экологическому воздействию. В связи с этим необходимо разработать быстрые и чувствительные методы раннего обнаружения цианобактерий и / или их токсинов в почве и воде. Для этого, мультиплекс флуоресцентный сэндвич микрочипов иммуноферментного анализа (FSMI) был разработан в качестве инструмента по управлению водными ресурсами, чтобы помочь им в принятии решений и, следовательно, в реализации программ по обеспечению надлежащего управления водными ресурсами.
Разнообразные методы были разработаны для обнаружения и идентификации Cyanobacterial клетки и цианотоксины в почве и воде, в том числе оптической микроскопии, молекулярной биологии и иммунологических методов. Эти методы могут значительно отличаться по информации, которую они предоставляют. Микроскопические методы основаны на клеточной морфологии и детекции флуоресценции в естественных условиях из цианобактерий пигментов, таких как фикоцианина или хлорофилл а 1. Несмотря на то, что они быстрые и дешевые методы в режиме реального времени и частого мониторинга , которые информируют о типе и количестве цианобактерии , присутствующих в образце, они не дают информации о потенциальной токсичности. Кроме того, они требуют определенного уровня знаний, принимая во внимание , что часто бывает очень трудно провести различие между близкородственными видами 2. Чтобы преодолеть эти ограничения, световая микроскопия должна сопровождаться как биологических, так и биохимических методов скрининга и физико-химических методов для идентификации и количественного определения цианотоксины.
<pкласс = "jove_content"> иммуноферментного анализа (ELISA), ингибирование белка фосфат анализы (PPIA) и нейрохимические тесты на мышах, являются примерами биохимических анализов скрининга для выявления цианотоксины. В то время как первые два быстрых и чувствительных методологий, ложных срабатываний были описаны при использовании тестов ELISA и PPIA ограничены тремя типами токсинов. Биоанализа мыши качественный метод, с низкой чувствительностью и точностью, а также специального лицензирования и подготовки не требуется. Кроме того, он не дает информации о типе токсинов, присутствующих в образце. Цианотоксины могут быть идентифицированы и количественно другими аналитическими методами, такими как высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ), жидкостная хроматография-масс-спектрометрии (ЖХ-МС), газовой хроматографии (ГХ), газовой хроматографии-масс-спектрометрии (ГХ-МС), или матрицы-активированная лазерная время десорбцией / ионизацией полета (MALDI-TOF). Однако это возможно только при условии ссылки на стандарты, которые должные изд , чтобы определить индивидуальные концентрации токсина в сложных образцах, доступны 3, 4. Кроме того, эти методы требуют больших затрат времени; требует дорогостоящего оборудования, расходных материалов и подготовки проб; и должны выполняться опытным и специализированным персоналом.Молекулярные методы , основанные применялись на протяжении десятилетий , чтобы обнаружить, идентифицировать и количественно оценить цианобактерии и соответствующие им цианотоксины благодаря информации о последовательности , опубликованной в базах данных генома (например, Национальный центр информации по биотехнологии, NCBI). Среди этих методов являются те, которые основаны на полимеразной цепной реакции (ПЦР), которая требует разработки наборов праймеров для амплификации ДНК и зависят от предыдущих знаний последовательностей ДНК различных видов цианобактерий. В то время как обнаружение гена, как Фикоцианин оперона, приводит к точной идентификации на уровне рода, некоторые виды или штаммы незамеченной сЭтот метод. Тем не менее, токсин , кодирующие гены, такие как те , которые принадлежат к микроцистина оперона, облегчить идентификацию токсинов в образцах , где производители не хватает 5. Тем не менее, обнаружение маркеров токсина с помощью ПЦР, не обязательно означает, токсичность в окружающей среде. Кроме того, набор праймеров , разработанных для анализа целого ряда видов цианобактерий и токсинов производителей , присутствующих в образце еще не завершен, и дальнейшие исследования должно быть сделано для выявления неизвестных видов. Другие молекулярные методы , не основанные на ПЦР, таких как флуоресценции в гибридизация (FISH) и ДНК – микрочипов в.
В последние два десятилетия, микрочипов технология приобрела значение во многих областях применения, в частности, в области экологического мониторинга. ДНК – микрочипов допускают дискриминации между видами и аналитов 4, 6, 7 , </SUP>, 8, 9, 10, но они считаются очень трудоемкий и занимает много времени задачи, связанные с нескольких шагов (например, производительность микрочипов, экстракции ДНК, ПЦР – амплификации и гибридизации). По этой причине, меньше времени анализы на основе антител, таких как сэндвич и конкурентных иммунологических микрочипов, стали важным и надежным методом с высокой пропускной способностью для обнаружения многочисленных экологических аналитов 11, 12, 13. Способность антител к специфически распознают их целевых соединений и для обнаружения малых количеств аналитов и белков, а также с возможностью получения антител против практически любого вещества, делают Microarrays антитела мощную технику для экологических целей. Кроме того, способность достижения мультипликатор анализов в качествеIngle анализ, с пределами обнаружения в диапазоне от миллиардных долей до миллионных долей, является одним из основных преимуществ этого метода 14.
Биосенсоры на основе антител, оказались чувствительными и быстрые инструменты для обнаружения широкого спектра патогенных микроорганизмов и токсинов в области экологического мониторинга 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21. В то время как методы ДНК включать несколько стадий, микрочипов на основе антител требуют лишь небольшой подготовки образца, который в основном базируется на коротком этапе лизиса в соответствующем буферном растворе. Delehanty и Ligler 15 сообщили одновременного обнаружения белков и бактериальных аналитов в сложных смесей на основе сэндвич – иммуноанализа антител , способный регистрировать концентрацию белка 4 частей на миллиард А.Н.d 10 4 КОЕ / мл клеток. Szkola и др. 21 разработали дешевый и надежный мультиплекс микрочипов для одновременного обнаружения proteotoxins и мелких токсинов, соединений , которые могут быть использованы в биологической войне. Они обнаружили концентрации рицина токсина, с пределом обнаружения 3 частей на миллиард, менее чем за 20 мин. В последнее время CYANOCHIP, антитело микрочипов на основе биосенсора для на месте залегания обнаружения токсичных и нетоксичных цианобактерий, был описан 22. Это микрочипов позволяет идентифицировать потенциальных расцветает цианобактерий, преимущественно в водной среде, которые трудно идентифицировать микроскопически. Предел обнаружения микрочипа составляет 10 2 – 10 3 клеток для большинства видов, превращая этот биосенсор в экономически эффективным инструментом для мультиплекса обнаружения и идентификации цианобактерий, даже на уровне отдельных видов. Все эти свойства делают antiboDy техника микрочипов, и в частности, метод, представленный в данной работе, более быстрый и простой способ по сравнению с вышеупомянутыми методами.
В работе представлены два примера экспериментов , которые используют антитела микрочипов биосенсора для обнаружения присутствия цианобактерий в почвенных и водных проб. Это простой и надежный метод, основанный на формате сэндвич иммунологического анализа, который требует очень небольших объемов образцов и очень простой подготовки образцов. Метод требует короткого времени, и может быть легко выполнено в полевых условиях.
Protocol
Representative Results
Discussion
Здесь мультиплекс флуоресцентный сэндвич – иммуноанализ с использованием CYANOCHIP, 17-антитело микрочип для обнаружения и идентификации широкого спектра цианобактерий родов, описывается 22. Эти цианобактерии представляют собой наиболее частые бентоса и планктона родов ?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Мы благодарим доктора Антонио Кесада из Автономного университета Мадрида для обеспечения штаммов цианобактериальными. Эта работа не была профинансирована Subdirección генерала де PROYECTOS де Investigación испанского Ministerio де Economía у Competitividad (MINECO), предоставляет не. AYA2011-24803 и ESP2014-58494-R.
Materials
| 0.22 mm pore diameter filters | Millipore | GSWP04700 | For preparation of immunogens |
| Eppendorf 5424R microcentrifuge | Fisher Scientific | For preparation of immunogens | |
| Phosphate buffer saline (PBS) pH 7.4 (10X) | Thermofisher Scientific | 70011036 | 50 mM potassium phosphate, 150 mM NaCl, pH 7.4 |
| Ultrasonic processor UP50H | Hielscher | For preparation of immunogens | |
| Complete Freund's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5881 | Immunopotentiator |
| Incomplete Freud's adjuvant | Sigma-Aldrich | F5506 | For boost injections |
| Protein A antibody purification kit | Sigma-Aldrich | PURE1A | For isolation of IgG |
| Centrifugal filter devices MWCO<100 KDa | Millipore | UFC510096-96K | For isolation of IgG |
| Dialysis tubings, benzoylated | Sigma-Aldrich | D7884-10FT | For isolation of IgG |
| Illustra Microspin G-50 columns | GE-HealthCare | GE27-5330-02 | For isolation of IgG |
| Bradford reagent | Sigma-Aldrich | B6916-500 mL | To quantify the antibody concentration |
| MicroBCA protein assay kit | Thermo Scientific | 23235 | To quantify the antibody concentration |
| Protein arraying buffer 2X | Whatman (Sigma Aldrich) | S00537 | Printing buffer; 30-40% glycerol in 1X PBS with 0.01% Tween 20 |
| Tween 20 | Sigma-Aldrich | P9416 | Non-ionic detergent |
| Bovine serum albumin (BSA) | Sigma-Aldrich | A9418 | Control for printing; blocking reagent |
| 384-wells microplate | Genetix | X6004 | For antibody printing |
| Robot arrayer for multiple slides | MicroGrid II TAS arrayer from Digilab | For antibody printing | |
| Epoxy substrate glass slides | Arrayit corporation | VEPO25C | Solid support for antibody printing |
| Alexa Fluor-647 Succinimidyl-ester | Molecular probes | A20006 | Fluorochrome |
| DMSO | Sigma-Aldrich | D8418 | Fluorochrome dissolvent |
| Heidolph Titramax vibrating platform shaker | Fisher Scientific | For antibody labeling | |
| Illustra Microspin G-50 columns | Healthcare | 27-5330-01 | For purification of labeled antibodies |
| Safe seal brown 0,5 ml tubes | Sarstedt | 72,704,001 | For labeled antibodies storage |
| Nanodrop 1000 spectrophotometer | Thermo Scientific | To quantify antibody concentration and labeling efficiency | |
| 3 µm pore size polycarbonate 47 mm diameter filter | Millipore | TMTP04700 | To concentrate cells |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 8 | Sigma-Aldrich | T3038 | For TBSTRR preparation; to block slides |
| Sodium chloride | Sigma-Aldrich | S7653 | For TBSTRR preparation |
| 20 µm nylon filters | Millipore | NY2004700 | For environmental extract preparation |
| 10-12 mm filter holders | Millipore | SX0001300 | For environmental extract preparation |
| Protease inhibitor cocktail | Sigma-Aldrich | P8340 | For environmental extract storage |
| 1M Trizma hydrochloride solution pH 9 | Sigma-Aldrich | T2819 | To block slides |
| Heidolph Duomax 1030 rocking platform shaker | VWR | To block slides; for incubation processes | |
| VWR Galaxy miniarray microcentrifuge | VWR | C1403-VWR | To dry slides |
| Multi-Well microarray hybridization cassette | Arrayit corporation | AHC1X24 | Cassette for 24 assays per slide |
| GenePix 4100A microarray scanner | Molecular Devices | Scanner for fluorescence | |
| GenePix Pro Software | Molecular Devices | Software for image analysis and quantification |
References
- Simis, S. G. H., Peters, S. W. M., Gons, H. J. Remote sensing of the cyanobacterial pigment phycocianin in turbid inland water. Limnol. Oceanogr. 50 (1), 237-245 (2005).
- Zamyadi, A., McQuaid, N., Prevost, M., Dorner, S. Monitoring of potentially toxic cyanobacteria using an online multi-probe in drinking water sources. J. Environ. Monit. 14, 579-588 (2012).
- Msagati, T. A. M., Siame, B. A., Shushu, D. D. Evaluation of methods for the isolation, detection and quantification of cyanobacterial hepatotoxins. Aquat. Toxicol. 78 (4), 382-397 (2006).
- Weller, M. G. Immunoassays and biosensors for the detection of cyanobacterial toxins in water. Sensors. 13 (11), 15085-15112 (2013).
- Baker, J. A., Neilan, B. A., Entsch, B., McKay, D. B. Identification of cyanobacteria and their toxigenicity in environmental samples by rapid molecular analysis. Environ. Toxicol. 16 (6), 472-482 (2001).
- Li, H., Singh, A. K., McIntyre, L. M., Sherman, L. A. Differential gene expression in response to hydrogen peroxide and the putative PerR regulon of Synechocystis sp. Strain PCC 6803. J. Bacteriol. 186 (11), 3331-3345 (2004).
- Anderson, D. M., Cembella, A. D., Hallegraeff, G. M. Progress in understanding harmful algal blooms: paradigm shifts and new technologies for research, monitoring, and management. Ann. Rev. Mar. Sci. 4, 143-176 (2012).
- Dittami, S. M., Pazos, Y., Laspra, M., Medlin, L. K. Microarray testing for the presence of toxic algae monitoring programme in Galicia (NW Spain). Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20, 6778-6793 (2013).
- Kegel, J. U., Del Amo, ., Medlin, Y., K, L. Introduction to Project MIDTAL: its methods and samples from Arcachon Bay, France. Environ. Sci. Pollut. Res. Int. 20 (10), 6690-6704 (2013).
- Marcheggiani, S., et al. Detection of emerging and re-emerging pathogens in surface waters close to an urban area. Int. J. Environ. Res. Public Health. 12 (5), 5505-5527 (2015).
- Fernández-Calvo, P., Näke, C., Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A multi-array competitive immunoassay for the detection of broad-range molecular size organic compounds relevant for astrobiology. Planet. Space Sci. 54 (815), 1612-1621 (2006).
- Parro, V. . Antibody microarrays for environmental monitoring. Handbook of Hydrocarbon and Lipid Microbiology. , 2699-2710 (2010).
- Fan, Z., Keum, Y. S., Li, Q. X., Shelver, W. L., Guo, L. H. Sensitive immunoassay detection of multiple environmental chemicals on protein microarrays using DNA/dye conjugate as a fluorescent label. J. Environ. Monit. 14 (5), 1345-1352 (2012).
- Rivas, L. A., García-Villadangos, M., Moreno-Paz, M., Patricia Cruz-Gil, P., Gómez-Elvira, J., Parro, V. A 200-Antibody microarray biochip for environmental monitoring: Searching for universal microbial biomarkers through immunoprofiling. Anal. Chem. 80 (21), 7970-7979 (2008).
- Delehanty, J. B., Ligler, F. S. A microarray immunoassay for simultaneous detection of proteins and bacteria. Anal. Chem. 74 (21), 5681-5687 (2002).
- Ligler, F. S., Taitt, C. R., Shriver-Lake, L. C., Sapsford, K. E., Shubin, Y., Golden, J. P. Array biosensor for detection of toxins. Anal. Bioanal. Chem. 377 (3), 469-477 (2003).
- Rucker, V. C., Havenstrite, K. L., Herr, A. E. Antibody microarrays for native toxin detection. Anal. Biochem. 339 (2), 262-270 (2005).
- Kang, J., Kim, S., Kwon, Y. Antibody-based biosensors for environmental monitoring. Toxicol. Environ. Health. Sci. 1 (3), 145-150 (2009).
- Herranz, S., Marazuela, M. D., Moreno-Bondi, M. C. Automated portable array biosensor for multisample microcystin analysis in freshwater samples. Biosens. Bioelectron. 33 (1), 50-55 (2012).
- Shlyapnikov, Y., et al. Rapid simultaneous ultrasensitive immunodetection of five bacterial toxins. Anal. Chem. 84 (13), 5596-5603 (2012).
- Szkola, A., et al. Rapid and simultaneous detection of ricin, staphylococcal enterotoxin B and saxitoxin by chemiluminescence-based microarray immunoassay. Analyst. 139, 5885-5892 (2014).
- Blanco, Y., Quesada, A., Gallardo-Carreño, I., Jacobo Aguirre, ., Parro, J., V, CYANOCHIP: An antibody microarray for high-taxonomical-resolution cyanobacterial monitoring. Environ. Sci. Technol. 49 (3), 1611-1620 (2015).
- Bradford, M. M. A Rapid and Sensitive Method for the Quantitation of Microgram Quantities of Protein Utilizing the Principle of Protein-Dye Binding. Anal. Chem. 72, 248-254 (1976).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J. Protein measurement with the Folin phenol reagent. J. Biol. Chem. 193 (1), 265-275 (1951).
- Smith, P. K., et al. Measurement of protein using Bicinchoninic acid. Anal. Biochem. 150 (1), 76-85 (1985).
- Rivas, L. A., Aguirre, J., Blanco, Y., González-Toril, E., Parro, V. Graph-based deconvolution analysis of multiplex sandwich microarray immunoassays: applications for environmental monitoring. Environ. Microbiol. 13 (6), 1421-1432 (2011).
- Blanco, Y., et al. Deciphering the prokaryotic community and metabolisms in south african deep-mine biofilms through antibody microarrays and graph theory. PloS One. 9 (2), e114180 (2014).
- Gas, F., Baus, B., Queré, J., Chapelle, A., Dreanno, C. Rapid detection and quantification of the marine toxic algae, Alexandrium minutum, using a super-paramagnetic immunochromatographic strip test. Talanta. 147, 581-589 (2016).
- Parro, V., et al. SOLID3: a multiplex antibody microarray-based optical sensor instrument for in situ life detection in planetary exploration. Astrobiology. 11, 15-28 (2011).
- McKay, C. P., et al. The Icebreaker Life Mission to Mars: a search for biomolecular evidence for life. Astrobiology. 13, 334-353 (2013).
