Transplantation soutenue d'échafaudage d'îlots dans la pate épididimale de souris diabétiques
Summary
Ce protocole démontre l'isolation des îlots murins et le semis sur un échafaud décellularisé. Les îlots soutenus par des échafaudages ont été transplantés dans la pate épididymique des souris diabétiques induites par la streptozotocine (STZ). Les îlots ont survécu au site de transplantation et ont inversé l'état hyperglycémique.
Abstract
La transplantation d'islet a été cliniquement prouvée pour être efficace dans le traitement du diabète de type 1. Cependant, la stratégie actuelle de transplantation intra-hépatique peut entraîner des réactions aigues du sang total et entraîner une mauvaise greffe d'îlot. Ici, nous signalons un protocole robuste pour la transplantation d'îlots sur le site de transplantation extrahépatique – le tampon gras épididymal (EFP) – sur un modèle de souris diabétique. Un protocole d'isolement et de purification des îlots aux rendements élevés de souris C57BL / 6J est décrit, ainsi qu'une méthode de transplantation réalisée par ensemencement d'îlots sur un échafaud décellularisé (DCS) et l'implantation au site EFP dans des souris C57BL / 6J syngéniques rendues diabétiques Par streptozotocine. Le greffon DCS contenant 500 îlots a inversé l'état hyperglycémiant dans les 10 jours, alors que les îlots libres sans DCS nécessitaient au moins 30 jours. La normoglycémie a été maintenue jusqu'à 3 mois jusqu'à ce que le greffon soit explanté. En conclusion, DCS a amélioré la greffe d'îlots en tLe site extrahépatique de l'EFP, qui pourrait facilement être récupéré et pourrait fournir une plate-forme reproductible et utile pour l'étude des matériaux d'échafaudage, ainsi que d'autres paramètres de transplantation requis pour une greffe d'îlot réussie.
Introduction
Le diabète mellitus de type 1 (T1D) est un trouble endocrinien auto-immune dans lequel les cellules d'îlot sont éliminées par le système immunitaire, ce qui rend les patients dépendants de l'injection d'insuline exogène pendant toute leur vie. Le protocole d'Edmonton représente un jalon dans les études cliniques de transplantation d'îlots; Les îlots ont été infusés à travers la veine porte et ont été transplantés au site intra-hépatique 1 . Cependant, deux principaux obstacles – sources insuffisantes d'îlots de donneurs et de greffe d'islet pauvres – empêchent le grand succès de la transplantation d'îlots 2 . Habituellement, les îlots doivent être collectés auprès de trois donneurs cadavériques pour inverser l'état hyperglycémique d'un patient; Ceci est dû au faible rendement des procédures d'isolement et à la perte d'îlot après la transplantation. En particulier, bien que les îlots post-transplantation soient baignés dans du sang riche en oxygène, le contact direct avec le sang a souvent provoqué l'inflammation induite par le sang instantané(IBMIR), ce qui pourrait provoquer une perte aigüe des îlots. À long terme, on pense que la perte progressive d'îlots chez les patients représentait la baisse des taux d'inversion du diabète dans les groupes cliniques, qui pourrait atteindre 90% en première année et a diminué à 30% et 10% par 2 et 5 Ans après la transplantation, respectivement 3 .
La transplantation d'islet sur des sites extra-hépatiques a été une stratégie attrayante pour réduire le contact direct des îlots avec du sang tout en confinant les transplantations à des endroits plus définissables par rapport à la perfusion intra-hépatique. Des études ont été menées dans la capsule du rein, des yeux, des muscles, des graisses et des espaces sous-cutanés au cours des dernières années, ce qui montre que les îlots sur ces sites peuvent survivre et fonctionner pour restaurer la normoglycémie 4 . En outre, les îlots sur ces sites sont récupérables, ce qui permet une biopsie ou même pour d'autres procédures de remplacement. Extraheptique sPar conséquent, il existe un grand potentiel de transplantation clinique 5 .
Des échafaudages à base de biomatériaux ont été intensément étudiés pour la transplantation cellulaire et l'ingénierie tissulaire. Les échafaudages tridimensionnels (3D) contiennent généralement des structures poreuses et peuvent servir de modèles cellulaires pour générer une structure spatiale / organisation de cellules ou des réservoirs pour fournir la libération contrôlée de repères bioactifs. Les échafaudages ont également été fabriqués à partir de matériaux polymères tels que le poly (glycolide-L-lactide) 6 , le poly (diméthylsiloxane) 7 et le poly (uréthane) thermoplastique 8 , pour transplanter les îlots dans l'EFP. Par rapport à la transplantation directe d'îlots, on a constaté l'utilisation d'échafaudages pour réduire la perte d'îlots en empêchant la fuite d'îlots dans la cavité intrapéritonéale 9 , 10 , en fournissant une protection mécanique et une moduLiant la réaction inflammatoire locale. Les échafaudages peuvent donc être développés pour favoriser la greffe d'islet sur les sites de transplantation 7 .
Dans cette étude, nous avons l'intention de démontrer un paradigme de la transplantation d'îlots dans l'EFP, réalisée dans des modèles de souris utilisant un DCS. Les échafaudages dérivés de matrices extracellulaires ont suscité un grand intérêt au cours des dernières années en raison de la biocompatibilité supérieure et des structures poreuses plus naturelles par rapport aux produits synthétiques. Ici, nous décrivons un protocole d'isolement robuste pour obtenir des îlots pancréatiques à des rendements élevés chez les souris C57BL / 6J. Les DCS fabriqués à partir du péricarde bovin ont ensuite été ensemencés avec des îlots et les greffes ont été transplantés à l'EFP dans des modèles diabétiques syngéniques. La normoglycémie chez la souris a été obtenue dans les 10 jours et a été maintenue jusqu'à 100 jours, jusqu'à l'élimination des greffons.
Protocol
Representative Results
Discussion
La perfusion de pancréas et le temps de digestion sont deux paramètres clés qui affectent le rendement et la qualité des îlots. Moskalewski a d'abord signalé l'utilisation d'un mélange brut de collagénase pour digérer le pancréas haché du cobaye 11 . Lacy et al. A signalé l'injection d'enzymes dans le système de conduits pour perfuser le pancréas, ce qui a considérablement augmenté le rendement en îlot 12 . La perfusion ductal …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Les auteurs souhaitent remercier Wei Zhang de Guanhao Biotech pour la fourniture des échafaudages décellularisés. Nous remercions Xiao-hong Peng pour les discussions utiles. Cette recherche a été soutenue financièrement par la National Natural Science Foundation of China (Projet n ° 331322021).
Materials
| Dissecting scissor | Ningbo Medical | ||
| Forceps | Ningbo Medical | ||
| 0.5 mm diameter wire mesh | Ningbo Medical | ||
| 70 μm cell strainer | Falcon | 352350 | |
| Artery hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Microscopic hemostatic clamp | Ningbo Medical | ||
| Hemostatic forceps | Ningbo Medical | ||
| Absorbable 6-0 PGLA sutures | JINHUAN | With needle | |
| Wound clip | Ningbo Medical | ||
| Cotton swab | Ningbo Medical | ||
| Gauze | Ningbo Medical | ||
| Sterile drapes | Ningbo Medical | ||
| 10mL syringe | JINGHUAN | ||
| 1 mL syringe | JINGHUAN | ||
| 27G intravenous needle | JINGHUAN | 0.45×15 RWSB | |
| 1.5 mL Eppendorf tube | Axygen | ||
| 15mL conical tube | Corning | 430791 | |
| 50mL conical tube | Corning | 430829 | |
| 35mm Non-treated Peri-dishes | Corning | 430588 | |
| Transwell | Corning | 3422 | |
| 0.22 μm filter | Pall | PN4612 | |
| 10 mL serological pipet | Corning | 4488 | |
| Pipet filler S1 | Thermo Scientific | 9501 | |
| Pipette (2-20μL) | Axygen | AP-20 | AXYPETTM |
| Dissecting microscope | Olympus | SZ61 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Hank’s balanced salt solution | Gibco | C14175500CP | |
| Collagenase P | Roche | COLLP-RO | |
| Histopaque 1077 | Sigma | 10771 | |
| RPMI 1640 | Gibco | 11879-20 | |
| FBS | Gibco | 16000-044 | |
| D-glucose | Gibco | A24940-01 | |
| Glucose meter | Roche | ACCU-CHEK | |
| Penicillin-streptomycin | Gibco | 15140-122 | |
| Streptozotocin | Sigma | V900890 | VetecTM |
| Chloral hydrate | J&K | C0073 | |
| Sodium citrate | Sigma | 71497 | |
| Citric acid | Sigma | C2404 | |
| Iodophors | Ningbo Medical | ||
| C57BL/6J, 10-12 weeks old | VitalRiver | Beijing, China | |
| Decellularized scaffold | Guanhao Biotec | 131102 | Guangzhou, China |
References
- Shapiro, A. M., et al. Islet transplantation in seven patients with type 1 diabetes mellitus using a glucocorticoid-free immunosuppressive regimen. N Engl J Med. 343, 230-238 (2000).
- Shapiro, A. M. J., et al. International Trial of the Edmonton Protocol for Islet Transplantation. N Engl J Med. 355, 1318-1330 (2006).
- Ryan, E. A., et al. Five-year follow-up after clinical islet transplantation. Diabetes. 54, 2060-2069 (2005).
- Merani, S., Toso, C., Emamaullee, J., Shapiro, A. M. Optimal implantation site for pancreatic islet transplantation. Br J Surg. 95, 1449-1461 (2008).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotechnol. 35 (1), (2017).
- Dufour, J. M., et al. Development of an ectopic site for islet transplantation, using biodegradable scaffolds. Tissue Eng. 11, 1323-1331 (2005).
- Weaver, J. D., et al. Controlled Release of Dexamethasone from Organosilicone Constructs for Local Modulation of Inflammation in Islet Transplantation. Tissue Eng Part A. 21, 2250-2261 (2015).
- Wang, K., et al. From Micro to Macro: The Hierarchical Design in a Micropatterned Scaffold for Cell Assembling and Transplantation. Adv Mater. 29, (2017).
- Blomeier, H., et al. Polymer Scaffolds as Synthetic Microenvironments for Extrahepatic Islet Transplantation. Transplantation. 82, 452-459 (2006).
- Gibly, R. F., et al. Extrahepatic islet transplantation with microporous polymer scaffolds in syngeneic mouse and allogeneic porcine models. Biomaterials. 32, 9677-9684 (2011).
- Moskalewski, S. Isolation and Culture of the Islets of Langerhans of the Guinea Pig. Gen Comp Endocrinol. 5, 342-353 (1965).
- Lacy, P. E., Kostianovsky, M. Method for the isolation of intact islets of Langerhans from the rat pancreas. Diabetes. 16, 35-39 (1967).
- Zmuda, E. J., Powell, C. A., Hai, T. A Method for Murine Islet Isolation and Subcapsular Kidney Transplantation. J Vis Exp. (50), (2011).
- Li, D. S., Yuan, Y. H., Tu, H. J., Liang, Q. L., Dai, L. J. A protocol for islet isolation from mouse pancreas. Nat Protoc. 4, 1649-1652 (2009).
- Stull, N. D., Breite, A., McCarthy, R., Tersey, S. A., Mirmira, R. G. Mouse Islet of Langerhans Isolation using a Combination of Purified Collagenase and Neutral Protease. J Vis Exp. (67), (2012).
- Sakata, N., Yoshimatsu, G., Tsuchiya, H., Egawa, S., Unno, M. Animal models of diabetes mellitus for islet transplantation. Exp Diabetes Res. , 256707 (2012).
- Schmidt, C. Pancreatic islets find a new transplant home in the omentum. Nat Biotech. 35, 8-8 (2017).
- Londono, R., Badylak, S. F. Biologic scaffolds for regenerative medicine: mechanisms of in vivo remodeling. Ann Biomed Eng. 43, 577-592 (2015).
