Low-Density primaire hippocampus Neuron Cultuur
Summary
Dit artikel beschrijft het protocol voor het kweken van lage dichtheid primaire hippocampale neuronen groeien op dekglaasjes omgedraaid naar een gliale monolaag. Het neuron en gliale lagen worden gescheiden door paraffinewas kralen. De neuronen gekweekt volgens deze methode geschikt voor hoge-resolutie optische beeldvorming en functionele assays.
Abstract
De mogelijkheid om de structuur en fysiologie van afzonderlijke zenuwcellen in kweek sonde is cruciaal voor de studie van neurobiologie en zorgt voor flexibiliteit in genetische en chemische manipulatie van afzonderlijke cellen of bepaalde netwerken. Dergelijke gemak van manipulatie is eenvoudiger in de gereduceerde cultuur systeem in vergelijking met de intacte hersenweefsel. Hoewel veel methoden voor de isolatie en groei van deze primaire neuronen bestaan, elk heeft zijn eigen beperkingen. Dit protocol beschrijft een werkwijze voor het kweken van lage-dichtheid en hoge zuiverheid knaagdier embryonale hippocampale neuronen op dekglaasjes, die vervolgens over een monolaag van gliale cellen gesuspendeerd. Deze 'sandwich cultuur' zorgt voor een exclusieve lange termijn groei van een populatie van neuronen en tegelijkertijd zorgen voor trofische steun van de onderliggende gliale monolaag. Wanneer neuronen van voldoende leeftijd of volwassenheid kan de neuron dekglaasjes worden omgedraaid-out van de gliale schaal en gebruikt bij beeldvorming of functionele assays. neuronen grown met deze methode meestal overleven gedurende enkele weken en de ontwikkeling van uitgebreide priëlen, synaptische verbindingen, en het netwerk eigenschappen.
Introduction
De hersenen is georganiseerd in ingewikkelde netwerken van neuronen. De bijdrage van individuele neuronen netwerkactiviteit en hersenfunctie kan bestudeerd worden door selectieve verandering van hun moleculaire samenstelling en perturbance hun fysiologische eigenschappen. Genetische en chemische manipulatie van individuele neuronen is misschien wel makkelijker in gekweekte neuronen dan in intacte hersenweefsel, vrij van cellulaire heterogeniteit en complexiteit van laatstgenoemde. Neuronen in kweek te ontwikkelen welbepaalde axonale en dendritische assen en vormen uitgebreide synaptische verbindingen met elkaar.
Terwijl neuron kweek van volwassen dieren of uit andere gebieden van het zenuwstelsel kan worden embryonale hippocampuskweken vaak de voorkeur vanwege hun gedefinieerde piramidale celpopulatie en relatief lage dichtheid gliale 1, 2. Hippocampale neuronen gekweekt bij lage dichtheid in kweek bijzonder ameNable de studie van subcellulaire lokalisatie, eiwittransport, neuronale polariteit en synaps ontwikkeling. Neuronen in cultuur zijn ook op grote schaal gebruikt in het bestuderen van moleculaire processen in synaptische plasticiteit 3, 4, 5, 6. Neuron cultuur bereidingen van muizen met een wereldwijde genetische deleties die niet postnataal wel overleefd hebben zijn vooral nuttig bij het bestuderen van cellulaire en synaptische functies van bepaalde genen 7 geweest.
Zoals in de hersenen, gekweekte hippocampale neuronen afhankelijk trofische ondersteuning van gliacellen. Dit bemoeilijkt hun cultuur, en heeft geleid tot de ontwikkeling van de verschillende manieren waarop deze ondersteuning wordt geleverd. Een algemeen gebruikte werkwijze omvat plating neuronen rechtstreeks op een monolaag van gliacellen 8 of waarbij verontreinigende gliacellen van het verkregen hippocampal weefsel prolifereren en vormen een monolaag onder de neuronen 9. Hoewel deze methode enig succes heeft gevonden, de onzuiverheid van de resulterende neuronale kweek is nadelig voor afbeeldexperimenten. Een andere veel gebruikte werkwijze voor het neuron cultuur te laten-de gliale feeder-laag geheel, en in plaats daarvan trofische ondersteuning in de vorm van een gedefinieerd kweekmedium 10.
Hier beschrijven we de "sandwich" of "Banker" methode van neuron cultuur 2, 11. Deze werkwijze omvat het uitplaten van de hippocampale neuronen op dekglaasjes, die vervolgens over een monolaag van gliacellen gescheiden door paraffinewas kralen gesuspendeerd. Dit vergemakkelijkt langetermijnkweek van een homogene populatie van neuronen zonder verontreinigende glia terwijl voor trofische ondersteuning van de onderliggende gliale monolaag. Wanneer neuronen van voldoende leeftijd of niveau van volwassenheid,het neuron dekglaasjes kan worden omgedraaid-out van de gliale schaal en gebruikt bij beeldvorming of functionele assays.
Protocol
Representative Results
Discussion
Terwijl de "sandwich" methode voor het kweken van neuronen is elders goed beschreven 2, 11, zijn er verschillende stappen in het hele protocol dat heel moeilijk om alleen te beschrijven in de tekst zijn, wat kan leiden tot frustratie voor onderzoekers die wensen aan te nemen.
De methode kan worden onderverdeeld in drie brede workflows: gliale cultuur, dekglaasje voorbereiding en neuron cultuur en onderhoud. Elk van de drie …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dit werk werd ondersteund door CIHR MOP-142209 naar TJS.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
