Cet article décrit le protocole pour la culture de neurones hippocampiques primaires de basse densité en croissance sur des lamelles de verre inversées sur une monocouche de cellules gliales. Les couches de neurones et de cellules gliales sont séparés par des billes de cire de paraffine. Les neurones cultivés par ce procédé sont appropriés pour l'imagerie optique à haute résolution et des essais fonctionnels.
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Article de méthode
Faible densité primaire hippocampique Neuron Culture
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Dans cet article
Résumé
Résumé
La capacité à sonder la structure et de la physiologie des cellules nerveuses individuelles dans la culture est essentielle pour l'étude de la neurobiologie, et permet une certaine souplesse dans la manipulation génétique et chimique des cellules individuelles ou des réseaux définis. Une telle facilité de manipulation est plus simple dans le système de culture réduite par rapport au tissu cérébral intact. Bien que de nombreuses méthodes pour l'isolement et la croissance de ces neurones primaires existent, chacun a ses propres limites. Ce protocole décrit un procédé de culture de faible densité et de haute pureté rongeurs embryonnaires neurones hippocampiques sur des lamelles de verre, qui sont ensuite mises en suspension sur une monocouche de cellules gliales. Cette « culture sandwich » permet une croissance exclusive à long terme d'une population de neurones tout en permettant un soutien trophique de la monocouche gliales sous-jacente. Lorsque les neurones sont suffisamment âgé ou au niveau de la maturité, les lamelles de neurones peut être basculé-out du plat gliale et utilisés dans l'imagerie ou des analyses fonctionnelles. g neuronesrown par cette méthode survivent généralement pendant plusieurs semaines et développer de vastes tonnelles, les connexions synaptiques et les propriétés du réseau.
Introduction
Le cerveau est organisé en réseaux complexes de neurones. La contribution des neurones individuels à l'activité du réseau et la fonction cérébrale peut être étudiée par une altération sélective de leur composition moléculaire et perturbance de leurs propriétés physiologiques. La manipulation génétique et chimique des neurones individuels est sans doute plus facile dans les neurones en culture que dans le tissu cérébral intact, non grevé par l'hétérogénéité et la complexité cellulaire de ce dernier. Neurones dans la culture se développent axonale bien définis et arborisation dendritique et forment de vastes connexions synaptiques entre eux.
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Protocole
Toutes les expériences et les protocoles des animaux de laboratoire ont été approuvés par le comité d'éthique animale Université du Manitoba et étaient conformes aux directives du Conseil canadien de protection des animaux.
1. Préparation des instruments, Tampons et solutions
- Stériliser par autoclavage tout l'équipement de dissection, pipettes Pasteur en verre, embouts de pipette, appareil de filtration, et de l'eau désionisée.
- Préparer 20% (p / v; 1,1 M) de solution de glucose stock dans de l'eau désionisée et de filtrage stériliser. Conserver à 4 ° C.
- Préparer une solution de pyruvate de so....
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Résultats
Dans cette méthode « sandwich » de la culture des cellules nerveuses primaires, les neurones hippocampiques (figure 3) se développent sur un lit de cellules gliales (figure 1) séparées par des billes de paraffine (Figure 2). Cela garantit que la croissance des neurones de manière sélective sur des lamelles de verre à la contamination des cellules gliales minimale mais reçoivent un soutien adéquat de la glie trophique de plus en plus sur .......
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Discussion
Bien que la méthode « sandwich » de la culture des neurones a été bien décrit par ailleurs 2, 11, il y a plusieurs étapes dans le protocole qui sont assez difficiles à décrire seul dans le texte, ce qui peut conduire à la frustration pour les chercheurs qui souhaitent adopter.
La méthode peut être divisée en trois grands flux de travail: culture gliales, préparation de la culture et de couvre-neurone et de maintenance. Chacune des tr.......
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Déclarations de divulgation
Les auteurs n'ont rien à dévoiler.
Remerciements
Ce travail a été soutenu par les IRSC RdP-142209 à TJS.
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Matériaux
| Nom | Entreprise | Numéro de catalogue | Commentaires |
|---|---|---|---|
| Dissection Instruments | |||
| Micro Ciseaux de dissection | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Ciseaux à ressort de dissection | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Ciseaux à ressort de dissection | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Pince (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Nom | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Préparation des tissus | |||
| Trypsine (2,5 %) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsine-EDTA (0,25 %) | Gibco | 25-200-072 | |
| Porte-filtre Swinnex, 25 ; mm | EMD Millipore | SX0002500 | Utilisé comme passoire à cellules. Assembler d’abord avec un filtre et un autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | ||
| Hémocytomètre | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Nettoyage des lentilles Tissu | GE Healthcare | 2105-841 | Utilisé comme passoire cellulaire. Assembler d’abord dans un porte-filtre et un autoclave Pipettes |
| Pasteur en verre avec filtre en coton | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank’s Balanced Salt Solution sans calcium, magnésium, rouge de phénol (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Pipettes Pasteur en verre | VWR | 14672-380 | |
| Désoxyribonucléase I du pancréas bovin (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane Bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Modèle 65 | |
| Centrifugeuse Eppendorf | 5810R | ||
| Nom | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Boîte de Pétri (100 mm) | Boîte | FB0875712 | |
| (60 mm) | Sérum de | FB0875713A | |
| Gibco | 16050-122 | Peut être utilisé à la place du BGS, mais chaque lot doit être testé en raison de la variation entre les lots. L’inactivation thermique du sérum est recommandée. | |
| Hydroxyde de sodium | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Pyruvate de sodium | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Milieu essentiel minimum (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Milieu neurobasal | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| Supplément GlutaMAX | Gibco | 35050061 | Peut être utilisé à la place de la L-Glutamine dans le milieu NBG |
| Boîte de culture (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Flacons de culture (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Sérum de croissance bovine (BGS) | HyClone | SH3054103 | L’inactivation par la chaleur est recommandée avant utilisation. |
| Supplément B27 (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Diméthyl Sulfoxyde (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Flacons cryogéniques | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoïque (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Nom | > | Numéro de catalogue | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromure | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffine Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Four à convection par gravité | VWR | 89511-404 | Utilisé pour la méthode alternative de nettoyage des lamelles discutée dans le protocole |
| Bain à ultrasons (sonisateur) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Anachemie | l’acide nitrique | 62786-460 | |
| Supports de coloration en céramique | Thomas Scientific | 8542E40 | Utilisé pour la méthode alternative de nettoyage des lamelles discutée dans le protocole |
| Couvre-lames | Glaswarenfabrik Karl Hecht ; Le fabricant de la GmbH | 1001/18 | est très important, car les neurones n’adhèrent pas bien au verre de qualité inférieure. |
| Acide Borique | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Nom | Company | Numéro de catalogue | Comments |
| >Divers | |||
| Filtres pour seringues stériles | VWR | 28145-477 | Utilisé avec la seringue BD pour seringue de stérilisation par filtre |
| ; | BD | 302832 | Utilisé avec les filtres à seringue stériles VWR pour la stérilisation |
| litre Bain d’eau | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Microscope inversé | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Tubes à centrifuger stériles coniques | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Tubes à centrifuger stériles coniques | ThermoScientific | 339652 |
Références
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al.
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Réimpressions et autorisations
