Low-Density Primær Hippocampus Neuron Culture
Summary
Denne artikkelen beskriver en protokoll for dyrking av lav tetthet primære hippocampale nerveceller som vokser på dekkglass på hodet over en glial monolag. Neuron og glial sjiktene er adskilt av parafinvoksperler. Nervecellene dyrkes ved denne metode er egnet for høy oppløsning optisk avbildning og funksjonelle analyser.
Abstract
Evnen til å undersøke strukturen og fysiologi av individuelle nerveceller i kultur er avgjørende for studiet av nevrobiologi, og gir rom for fleksibilitet i genetisk og kjemisk manipulering av enkeltceller eller definerte nettverk. En slik lett manipulering er enklere i det reduserte kultursystemet sammenlignet med det intakte hjernevev. Selv om mange fremgangsmåter for isolering og vekst av disse primære neuroner finnes, hver har sine egne begrensninger. Denne protokollen beskriver en fremgangsmåte for dyrking av lav tetthet og med høy renhet embryoniske gnager hippocampalneuroner på dekkglass, som deretter forløper over et monolag av gliaceller. Denne 'sandwich-kultur' gir mulighet for eksklusive langsiktig vekst av en populasjon av nerveceller, samtidig som for trofisk støtte fra den underliggende glial monolayer. Når neuroner er av tilstrekkelig alder eller modenhet, kan nervecellen Dekk vippes ut av glial fatet og anvendt i avbildning eller funksjonelle analyser. Nerveceller grown av denne metoden vanligvis overleve i flere uker og utvikle omfattende lysthus, synaptiske forbindelser og nettverksegenskaper.
Introduction
Hjernen er organisert i intrikate nettverk av nerveceller. Bidraget av individuelle neuroner overfor nettaktivitet og hjernefunksjonen kan studeres ved selektiv endring av deres molekylære sammensetning og perturbance av deres fysiologiske egenskaper. Genetisk og kjemisk manipulering av individuelle nevroner er kanskje enklere i dyrkede nerveceller enn i intakte hjernevev, uhemmet av sistnevntes cellulær heterogenitet og kompleksitet. Neuroner i kultur utvikle veldefinert aksonal og dendrittiske arbors og danner omfattende synaptiske forbindelser med hverandre.
Mens neuron kultur fra voksne dyr eller fra andre regioner av nervesystemet er mulig, blir embryoniske hippocampale kulturer ofte foretrukket grunnet sin definert pyramidal cellepopulasjon og forholdsvis lav densitet glial 1, 2. Hippocampalneuroner dyrket ved lav tetthet i kulturen er spesielt amenable til studiet av subcellulære lokalisering, protein handel, neuronal polaritet og synapse utvikling. Neuroner i kultur er også blitt omfattende anvendt for å studere molekylære prosesser i synaptisk plastisitet 3, 4, 5, 6. Neuron kultur preparater fra mus med globale genetiske slettinger som ikke overlever fødselen har vært spesielt nyttig i å studere cellulære og synaptiske roller visse gener 7.
Som i hjernen, dyrkede hippocampale neuroner er avhengig av trofisk støtte fra gliaceller. Dette kompliserer deres kultur, og har ført til utvikling av flere forskjellige fremgangsmåter ved hvilke denne støtten er som følger. En vanlig anvendt metode omfatter plette neuroner direkte på et monolag av gliaceller 8, eller slik at forurensende gliaceller fra den innhentede Hippocampal vev å proliferere og danne et monolag under neurons 9. Selv om denne metoden har funnet en viss suksess, forurensningen av den resulterende neuronal kulturen er ufordelaktig for bildebehandling eksperimenter. En annen vanlig anvendt metode for neuron kulturen er å la ut glial matelag helt, og i stedet gi trofisk støtte i form av en definert vekstmedium 10.
Her beskriver vi "sandwich" eller "Banker" metode for neuron kultur 2, 11. Denne metoden innebærer å belegge hippocampalneuroner på dekkglass, som deretter forløper over et monolag av gliaceller adskilt av parafinvoksperler. Dette muliggjør langtidskultur av en homogen populasjon av nerveceller uten å forurense glia, samtidig som for trofisk støtte fra den underliggende glial monolag. Når nerveceller er av tilstrekkelig alder eller modenhetsnivå,nervecellen Dekkglass kan vippes ut av glial fatet og anvendt i avbildning eller funksjonelle analyser.
Protocol
Representative Results
Discussion
Mens "sandwich" metode for dyrking nevroner har vært godt beskrevet andre steder 2, 11, er det flere trinn i hele protokollen som er ganske vanskelig å beskrive med tekst alene, som kan føre til frustrasjon for forskere som ønsker å adoptere den.
Fremgangsmåten kan deles inn i tre hovedarbeidsprosesser: glial kultur, dekkglass og forberedelse neurondyrking og vedlikehold. Hver av de tre preparatene er avgjørende for …
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Dette arbeidet ble støttet av CIHR MOP-142209 til TJS.
Materials
| Dissection Instruments | |||
| Micro Dissecting Scissors | Roboz | RS-5910 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5650 | |
| Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz | RS-5605 | |
| Dumont Forceps (#5) | Roboz | RS-5045 | |
| Dumont Forceps (#PP) | Roboz | RS-4950 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Preparation | |||
| Trypsin (2.5%) | Gibco | 15-090-046 | |
| Trypsin-EDTA (0.25%) | Gibco | 25-200-072 | |
| Swinnex Filter Holder, 25 mm | EMD Millipore | SX0002500 | Used as cell strainer. Assemble first with filter and autoclave |
| Isoflorane | Pharmaceutical Partners of Canada Inc. | CP0406V2 | |
| Hemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | |
| Grade 105 Lens Cleaning Tissue | GE Healthcare | 2105-841 | Used as cell strainer. Assemble first in filter holder and autoclave |
| Glass Pasteur pipettes with cotton filter | VWR | 14672-412 | |
| HEPES (1 M) | Gibco | 15-630-080 | |
| Hank's Balanced Salt Solution without Calcium, Magnesium, Phenol Red (HBSS, 10x) | Gibco | 14-185-052 | |
| Glass Pasteur pipettes | VWR | 14672-380 | |
| Deoxyribonuclease I from bovine pancreas (Dnase) | Sigma-Aldrich | DN25-100mg | |
| Butane bunsen burner | Wall-Lenk Mfg. Co. | Model 65 | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5810R | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Tissue Culture | |||
| Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL) | Gibco | 15-140-122 | |
| Petri Dish (100 mm) | Fisher | FB0875712 | |
| Petri Dish (60 mm) | Fisher | FB0875713A | |
| Horse Serum | Gibco | 16050-122 | Can be used in place of BGS, but each lot must be tested due to inter-lot variation. Heat-inactivation of serum is recommended. |
| Sodium Hydroxide | Fisher Scientific | S318-1 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma-Aldrich | P2256 | |
| Minimum Essential Medium (MEM) | Gibco | 11-095-080 | |
| Neurobasal Medium | Gibco | 21-103-049 | |
| L-Glutamine (200 mM) | Gibco | 25-030-081 | |
| GlutaMAX Supplement | Gibco | 35050061 | Can be used in place of L-Glutamine in the NBG medium |
| Culture Dish (60 mm) | Corning, Inc | 353002 | |
| Culture Flasks (75 cm^2) | Greiner Bio-One | 658170 | |
| Cytarabine (Ara-C) | Sigma-Aldrich | C3350000 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | |
| Bovine Growth Serum (BGS) | HyClone | SH3054103 | Heat-inactivation is recommended before use. |
| B27 Supplement (50x) | Gibco | 17-504-044 | |
| Dimethyl Sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D8418-100ml | |
| Cryogenic Vials | VWR | 89094-806 | |
| DL-2-Amino-5-phosphonopentanoic acid (APV) | Sigma-Aldrich | A5282 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Coverslip Preparation | |||
| Sodium tetraborate decahydrate (borax) | Sigma-Aldrich | B9876-1KG | |
| Poly-L-Lysine Hydrobromide | Sigma-Aldrich | P2636 | |
| Histoplast Paraffin Wax | Fisher | 22-900-700 | |
| Gravity Convection Oven | VWR | 89511-404 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Ultrasonic Bath (Sonicator) | Fisher Scientific | 15337400 | |
| Nitric Acid | Anachemia | 62786-460 | |
| Ceramic Staining Racks | Thomas Scientific | 8542E40 | Used for alternative coverslip cleaning method discussed in protocol |
| Coverslips | Glaswarenfabrik Karl Hecht GmbH | 1001/18 | Manufacturer is very important, as neurons do not adhere well to lower quality glass |
| Boric Acid | Sigma-Aldrich | B0252 | |
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Miscellaneous | |||
| Sterile Syringe Filters | VWR | 28145-477 | Used with BD syringe for filter-sterilization |
| Syringe | BD | 302832 | Used with VWR sterile syringe filters for fliter-sterilization |
| Water Bath | Fisher Scientific | 15-460-16Q | |
| Inverted Microscope | Olympus | CKX41 | |
| 15 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339650 | |
| 50 mL Conical Sterile Centrifuge Tubes | ThermoScientific | 339652 |
References
- Banker, G. A., Cowan, W. M. Rat hippocampal neurons in dispersed cell culture. Brain Res. 126, 397-425 (1977).
- Kaech, S., Banker, G. Culturing hippocampal neurons. Nat Protoc. 1, 2406-2415 (2006).
- Adamantidis, A., et al. Optogenetics: 10 years after ChR2 in neurons–views from the community. Nat Neurosci. 18, 1202-1212 (2015).
- Ho, V. M., Lee, J. A., Martin, K. C. The cell biology of synaptic plasticity. Science. 334, 623-628 (2011).
- Huganir, R. L., Nicoll, R. A. AMPARs and synaptic plasticity: the last 25 years. Neuron. 80, 704-717 (2013).
- Luscher, C., et al. Role of AMPA receptor cycling in synaptic transmission and plasticity. Neuron. 24, 649-658 (1999).
- Varoqueaux, F., et al. Neuroligins determine synapse maturation and function. Neuron. 51, 741-754 (2006).
- Huettner, J. E., Baughman, R. W. Primary culture of identified neurons from the visual cortex of postnatal rats. J Neurosci. 6, 3044-3060 (1986).
- Lester, R. A., Quarum, M. L., Parker, J. D., Weber, E., Jahr, C. E. Interaction of 6-cyano-7-nitroquinoxaline-2,3-dione with the N-methyl-D-aspartate receptor-associated glycine binding site. Mol Pharmacol. 35, 565-570 (1989).
- Brewer, G. J., Torricelli, J. R., Evege, E. K., Price, P. J. Optimized survival of hippocampal neurons in B27-supplemented Neurobasal, a new serum-free medium combination. J Neurosci Res. 35, 567-576 (1993).
- Goslin, K., Asmussen, H., Banker, G., Banker, G., Goslin, K. Rat hippocampal neurons in low-density culture. Culturing nerve cells. 2, 339-370 (1998).
- Hanisch, U. K. Microglia as a source and target of cytokines. Glia. 40, 140-155 (2002).
