Nucleare spettroscopia di risonanza magnetica per l'identificazione di più di fosforilazioni intrinsecamente disordinati proteine

Summary

We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.

Abstract

Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.

Introduction

Una delle principali sfide della sanità nel 21 ^° secolo, sono le malattie neurodegenerative come il morbo di Alzheimer (AD). Tau è una proteina associata ai microtubuli che stimola microtubuli (MT) formazione. Tau è ugualmente coinvolto in diverse malattie neurodegenerative, le cosiddette tauopatie, di cui il più noto è AD. In questi disturbi, Tau auto-aggregati in filamenti elicoidali appaiati (PHFS) e si trova modifica per molti residui di modificazioni post-(PTM), come la fosforilazione ^1. La fosforilazione della proteina tau è implicata nella regolazione sia della sua funzione fisiologica di stabilizzazione MT e la perdita patologica di funzione che caratterizza i neuroni AD.

Inoltre, la proteina Tau, se integrato in PHFS nei neuroni malati, è invariabilmente hyperphosphorylated ^2. A differenza di Tau normale che contiene 2-3 gruppi fosfato, il Tau iperfosforilata in PHFS contiene 5-9 Phosphate gruppi ^3. Iperfosforilazione di Tau corrisponde sia ad un aumento della stechiometria in alcuni siti e fosforilazione di altri siti che sono chiamati siti patologici di fosforilazione. Tuttavia, esiste sovrapposizione tra AD e modelli normali adulti di fosforilazione, nonostante le differenze quantitative nel livello ^4. Come specifica eventi di fosforilazione funzione di influenza e la disfunzione di Tau rimane in gran parte sconosciuta. Il nostro obiettivo è di decifrare regolamento Tau dal PTM a livello molecolare.

Per approfondire la comprensione degli aspetti molecolari di Tau, dobbiamo affrontare sfide tecniche. In primo luogo, è una proteina Tau intrinsecamente disordinati (IDP) quando isolato in soluzione. Tali proteine ​​mancano ben definita struttura tridimensionale in condizioni fisiologiche e richiedono particolari metodi biofisici per studiare la funzione (s) e le proprietà strutturali. Tau è un paradigma per la crescente classe degli sfollati, che spesso si trovano associatopatologie quali le malattie neurodegenerative, aumentando così l'interesse per comprendere i parametri molecolari sottostanti le loro funzioni. In secondo luogo, la caratterizzazione di Tau fosforilazione è una sfida analitica, con 80 potenziali siti di fosforilazione lungo la sequenza più lunga 441 amminoacidi Tau isoforma. Un certo numero di anticorpi sono stati sviluppati contro epitopi fosforilate di Tau e sono utilizzati per il rilevamento di proteina tau nei neuroni o tessuto cerebrale. eventi di fosforilazione possono avvenire su almeno 20 siti presi di mira da chinasi prolina-diretto, la maggior parte dei quali in prossimità nella regione ricca di prolina. La qualitativo (quali siti?) E quantitativa (cosa stechiometria?) Caratterizzazione è difficile anche dalle più recenti tecniche di MS ^5.

spettroscopia NMR può essere usato per studiare le proteine ​​disordinate che sono altamente sistemi dinamici costituiti da gruppi di conformeri. spettroscopia NMR ad alta risoluzione è stato appliEd a indagare sia la struttura e la funzione della proteina Tau. Inoltre, la complessità del profilo fosforilazione di Tau ha portato allo sviluppo di strumenti molecolari e nuovi metodi analitici utilizzando NMR per l'identificazione dei siti di fosforilazione ^{6 – 8.} NMR come metodo analitico consente l'identificazione dei siti di fosforilazione Tau in modo globale, visualizzazione di tutte le modifiche single-site in un singolo esperimento, e la quantificazione del grado di incorporazione di fosfato. Questo punto è essenziale in quanto, anche se gli studi di fosforilazione di Tau abbondano nella letteratura, la maggior parte di loro sono stati eseguiti con anticorpi, lasciando un ampio margine di incertezza sul profilo completo di fosforilazione e quindi il vero impatto di singoli eventi di fosforilazione. chinasi ricombinanti tra PKA, glicogeno-sintasi chinasi 3β (Gsk3β), ciclina-dipendente chinasi 2 / ciclina A (CDK2 / CYCA), ciclina-dipendente chinasi 5 (CDK5) / p25 attoproteine ​​ivator, extracellulare segnale-regolate chinasi 2 (ERK2) e microtubuli-affinità di regolazione chinasi (MARK), che mostrano l'attività fosforilazione verso Tau, possono essere preparati in una forma attiva. Inoltre, Tau mutanti che permettono per la generazione di specifiche isoforme della proteina Tau con i modelli di fosforilazione ben caratterizzati sono utilizzati per decifrare il codice di fosforilazione di Tau. Spettroscopia NMR viene quindi utilizzato per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati ^{6 – 8.} Anche se in vitro fosforilazione di Tau è più impegnativo di pseudo-fosforilazione come per mutazione di selezionati Ser / Thr in residui di acido glutammico (Glu), questo approccio ha i suoi meriti. Infatti, né i impatto né di interazione parametri strutturali di fosforilazione possono sempre essere imitato da acidi glutammico. Un esempio è il motivo turno osservato intorno fosfoserina 202 (pSer202) / phosphothreonine 205 (pThr205), che non è riprodotto con Glu mutazioni ^9.

<p class = "jove_content"> Qui, la preparazione di isotopicamente marcato Tau per indagini NMR verrà descritto prima. proteina tau fosforilata da ERK2 viene modificato su numerosi siti descritti come siti patologiche di fosforilazione, e rappresenta quindi un interessante modello di Tau hyperphosphorylated. Un protocollo dettagliato di Tau de fosforilazione vitro da ricombinante ERK2 chinasi è presentato. ERK2 viene attivata dalla fosforilazione da mitogeni activated protein chinasi / ERK chinasi (MEK) ^{10 – 12.} Oltre alla preparazione di modificato, proteina Tau isotopicamente marcati, la strategia NMR utilizzato per l'identificazione del PTM è descritto.

Protocol

1. Produzione di 15 N, 13 C-Tau (figura 1) Trasforma pET15b-Tau ricombinante T7 plasmide di espressione 13,14 in BL21 (DE3) competente Escherichia coli cellule batteriche 15. NOTA: la codifica cDNA per la più lunga (441 residui di aminoacidi) Tau isoforma viene clonato tra NcoI e XhoI siti di restrizione del plasmide pET15b. Mescolare delicatamente 50 ml di BL21 competente cellule (DE3), formando 1-5 x 10 7 colo…

Representative Results

La figura 3A mostra un grande picco di assorbimento a 280 nm osservati durante il gradiente di eluizione. Questo picco corrisponde alla proteina Tau purificata come visto sul gel di acrilammide sopra il cromatogramma. Figura 3B mostra un picco di assorbimento ben separati a 280 nm e picco di conducibilità, assicurando che dissalazione della proteina è efficiente. La figura 4 mostra proteina gel-shift osservato mediante analisi SDS-PAGE 16 caratteristico multiple fosforilazione …

Discussion

Abbiamo usato la spettroscopia NMR per caratterizzare campioni Tau enzimaticamente modificati. L'espressione ricombinante e purificazione qui descritta per la proteina Tau umano full-length possono allo stesso modo essere utilizzati per produrre mutanti Tau o Tau domini. Isotopicamente proteina arricchito è necessaria per la spettroscopia NMR, rendendo necessario l'espressione ricombinante. Identificazione dei siti di fosforilazione richiede l'assegnazione di risonanza e un ¹⁵ N, ¹³ C …

Materials

pET15B recombinant T7 expression plasmid	Novagen	69257	Keep at -20°C
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria	New England Biolabs	C2527I	Keep at -80°C
Autoclaved LB Broth, Lennox	DIFCO	240210	Bacterial Growth Medium
MEM vitamin complements 100X	Sigma	58970C	Bacterial Growth Medium Supplement
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder	Sigma	608297	Bacterial Growth Medium Supplement
15NH4Cl	Sigma	299251	Isotope
13C6-Glucose	Sigma	389374	Isotope
Protease inhibitor tablets	Roche	5056489001	Keep at 4°C
			1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C
DNaseI	EUROMEDEX	1307	Keep at -20°C
Homogenizer (EmulsiFlex-C3)	AVESTIN		Lysis is realized at 4°C
Pierce™ Unstained Protein MW Marker	Pierce	266109
Active human MEK1 kinase, GST Tagged	Sigma	M8822	Keep at -80°C
AKTÄ Pure chromatography system	GE Healthcare		FPLC
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column)	GE Healthcare	17-5156-01	Cation exchange chromatography columns
HiPrep 26/10 Desalting	GE Healthcare	17-5087-01	Protein Desalting column
PD MidiTrap G-25	GE Healthcare	28-9180-08	Protein Desalting column
Tris D11, 97% D	Cortecnet	CD4035P5	Deuterated NMR buffer
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe)	Euriso-top	BMS-005B	NMR Shigemi Tubes
eVol kit-electronic syringe starter kit	Cortecnet	2910000	Pipetting
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead	Bruker		NMR spectrometer for data acquisition
TopSpin 3.1	Bruker		Acquisition and Processing software for NMR experiments
Sparky 3.114	UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller)		NMR data Analysis software