We describe here a method to identify multiple phosphorylations of an intrinsically disordered protein by Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy (NMR), using Tau protein as a case study. Recombinant Tau is isotopically enriched and modified in vitro by a kinase prior to data acquisition and analysis.
Aggregates of the neuronal Tau protein are found inside neurons of Alzheimer’s disease patients. Development of the disease is accompanied by increased, abnormal phosphorylation of Tau. In the course of the molecular investigation of Tau functions and dysfunctions in the disease, nuclear magnetic resonance (NMR) spectroscopy is used to identify the multiple phosphorylations of Tau. We present here detailed protocols of recombinant production of Tau in bacteria, with isotopic enrichment for NMR studies. Purification steps that take advantage of Tau’s heat stability and high isoelectric point are described. The protocol for in vitro phosphorylation of Tau by recombinant activated ERK2 allows for generating multiple phosphorylations. The protein sample is ready for data acquisition at the issue of these steps. The parameter setup to start recording on the spectrometer is considered next. Finally, the strategy to identify phosphorylation sites of modified Tau, based on NMR data, is explained. The benefit of this methodology compared to other techniques used to identify phosphorylation sites, such as immuno-detection or mass spectrometry (MS), is discussed.
En av de största utmaningarna för hälso- och sjukvård i det 21: a århundradet är neurodegenerativa sjukdomar såsom Alzheimers sjukdom (AD). Tau är en mikrotubuli-associerat protein som stimulerar mikrotubulus (MT) bildning. Tau är lika involverad i flera neurodegenerativa sjukdomar, så kallade tauopatier, varav den mest kända är AD. I dessa sjukdomar, är Tau själv aggregat i parade spiralfilament (PHF) och fann modifierad på många rester av posttranslationella modifieringar (PTMs) såsom fosforylering 1. Fosforylering av tau-protein är inblandad i både reglering av dess fysiologiska funktion av MT stabilisering och patologisk förlust av funktion som kännetecknar AD neuroner.
Dessutom Tau protein, när den integreras i PHF i sjuka neuroner är alltid hyperfosforylerat 2. Till skillnad från normal Tau som innehåller 2-3 fosfatgrupper, det hyperfosforylerade Tau i PHF innehåller 5-9 Phosphate grupper 3. Hyperfosforylering av Tau motsvarar både en ökning med stökiometri på vissa platser och fosforylering av ytterligare platser som kallas patologiska ställen för fosforylering. Det finns dock överlappningen mellan AD och normala vuxna mönster fosforylering, trots kvantitativa skillnader i nivån 4. Hur specifik fosforylering händelser påverkar funktion och dysfunktion i Tau är i stort sett okända. Vi strävar efter att dechiffrera Tau reglering av PTMs på molekylär nivå.
Att fördjupa förståelsen för de molekylära aspekterna av Tau, måste vi ta itu tekniska utmaningar. För det första är Tau en egen oordnad protein (IDP) när isolerades i lösning. Sådana proteiner saknar väldefinierade tredimensionella strukturen under fysiologiska förhållanden och kräver särskilda biofysikaliska metoder för att studera deras funktion (er) och strukturella egenskaper. Tau är ett paradigm för den växande klassen av internflyktingar, som ofta förekommer i samband medpatologier såsom neurodegenerativa sjukdomar, därmed öka intresset för att förstå de molekylära parametrar som ligger bakom deras funktioner. För det andra är karakteriseringen av Tau fosforylering ett analytiskt utmaning, med 80 potentiella fosforyleringsställen längs sekvensen för den längsta 441 aminosyra Tau-isoformen. Ett antal antikroppar har utvecklats mot fosforylerade epitoper av Tau och används för detektion av patologiska Tau i nervceller eller hjärnvävnad. Fosforylering händelser kan ske på åtminstone 20 platser som omfattas av prolin-riktade kinaser, de flesta av dem i närheten inom Proline-rik region. Den kvalitativa (vilka webbplatser?) Och kvantitativa (vilken stökiometri?) Karakterisering är svårt även av de senaste MS-tekniker 5.
NMR-spektroskopi kan användas för att undersöka oordnade proteiner som är mycket dynamiska system består av ensembler av konformerer. Högupplöst NMR-spektroskopi var tillämped att undersöka både struktur och funktion av Tau-proteinet. Dessutom komplexiteten i Tau s fosforylering profil ledde till utvecklingen av molekylära verktyg och nya analysmetoder som använder NMR för identifiering av fosforyleringsställen 6 – 8. NMR som en analysmetod möjliggör identifiering av Tau fosforyleringsställen i ett globalt sätt, visualisering av alla single-site ändringar i ett enda experiment, och kvantifiering av graden av fosfat inkorporering. Denna punkt är viktig eftersom även fosforylering studier på Tau överflöd i litteraturen, de flesta av dem har utförts med antikroppar, vilket ger en hög grad av osäkerhet över hela profilen för fosforylering och därmed den verkliga effekterna av enskilda fosforylering händelser. Rekombinanta kinaser inklusive PKA, Glykogen-syntas kinas 3β (GSK3P), cyklin-beroende kinas 2 / cyklin A (CDK2 / CycA), cyklin-beroende kinas 5 (CDK5) / p25 agerarivator protein, extracellulär-signal-reglerat kinas 2 (ERK2) och mikrotubulus-affinitet reglerande kinas (MARK), vilka visar fosforylering aktivitet mot Tau, kan framställas i en aktiv form. Dessutom är Tau-mutanter som möjliggör för generering av specifika Tau proteinisoformer med välkarakteriserade fosforyleringsställen mönster som används för att dechiffrera fosforyleringen koden Tau. NMR-spektroskopi används sedan för att karakterisera enzymatiskt modifierade Tau prover 6 – 8. Även in vitro fosforylering av Tau är mer utmanande än pseudo-fosforylering såsom genom mutation av utvalda Ser / Thr i glutaminsyra (Glu) rester, har denna metod sina förtjänster. I själva verket kan varken strukturella effekter eller interaktion parametrar fosforylering alltid imiteras av glutaminsyra. Ett exempel är tur motiv observeras runt fosfoserin 202 (pSer202) / fosfotreonin 205 (pThr205), som inte återges med Glu mutationer 9.
<p class = "jove_content"> Här kan framställning av isotopmärkt Tau för NMR-undersökningar kommer att beskrivas först. Tau-protein fosforyleras av ERK2 modifieras på många platser som beskrivs som patologiska ställen för fosforylering och därmed utgör en intressant modell för hyperfosforylerat Tau. En detaljerad protokoll Tau in vitro fosforylering av rekombinant ERK2-kinas presenteras. ERK2 aktiveras genom fosforylering av mitogen aktiverat proteinkinas / ERK-kinas (MEK) 10-12. Förutom framställningen av modifierade, isotopinmärkt Tau-protein, är NMR strategi som används för identifiering av PTMs beskrivits.Vi har använt NMR-spektroskopi för att karaktärisera enzymatiskt modifierade Tau prover. Den rekombinanta expression och rening beskrivs här för fullängds humant tau-protein kan på liknande sätt användas för att producera mutanta Tau eller Tau-domäner. Isotop behövs berikad protein för NMR-spektroskopi, vilket kräver rekombinant uttryck. Identifiering av fosforyleringsställen kräver resonans uppdrag och en 15 N, 13 C dubbelt märkt protein. Med tanke på kostnaden av isotoper är go…
The authors have nothing to disclose.
The NMR facilities were funded by the Région Nord, CNRS, Pasteur Institute of Lille, European Community (FEDER), French Research Ministry and the University of Sciences and Technologies of Lille. We acknowledge support from the TGE RMN THC (FR-3050, France), FRABio (FR 3688, France) and Lille NMR and RPE Health and Biology core facility. Our research is supported by grants from the LabEx (Laboratory of Excellence) DISTALZ (Development of Innovative Strategies for a Transdisciplinary approach to Alzheimer’s disease), EU ITN TASPPI and ANR BinAlz.
pET15B recombinant T7 expression plasmid | Novagen | 69257 | Keep at -20°C |
BL21(DE3) transformation competent E.coli bacteria | New England Biolabs | C2527I | Keep at -80°C |
Autoclaved LB Broth, Lennox | DIFCO | 240210 | Bacterial Growth Medium |
MEM vitamin complements 100X | Sigma | 58970C | Bacterial Growth Medium Supplement |
15N, 13C-ISOGRO complete medium powder | Sigma | 608297 | Bacterial Growth Medium Supplement |
15NH4Cl | Sigma | 299251 | Isotope |
13C6-Glucose | Sigma | 389374 | Isotope |
Protease inhibitor tablets | Roche | 5056489001 | Keep at 4°C |
1 tablet in 1ml is 40X solution that can be kept at -20°C | |||
DNaseI | EUROMEDEX | 1307 | Keep at -20°C |
Homogenizer (EmulsiFlex-C3) | AVESTIN | Lysis is realized at 4°C | |
Pierce™ Unstained Protein MW Marker | Pierce | 266109 | |
Active human MEK1 kinase, GST Tagged | Sigma | M8822 | Keep at -80°C |
AKTÄ Pure chromatography system | GE Healthcare | FPLC | |
HiTrap SP Sepharose FF (5 mL column) | GE Healthcare | 17-5156-01 | Cation exchange chromatography columns |
HiPrep 26/10 Desalting | GE Healthcare | 17-5087-01 | Protein Desalting column |
PD MidiTrap G-25 | GE Healthcare | 28-9180-08 | Protein Desalting column |
Tris D11, 97% D | Cortecnet | CD4035P5 | Deuterated NMR buffer |
5 mm Symmetrical Microtube SHIGEMI D2O ( set of 5 inner & outerpipe) | Euriso-top | BMS-005B | NMR Shigemi Tubes |
eVol kit-electronic syringe starter kit | Cortecnet | 2910000 | Pipetting |
Bruker 900MHz AvanceIII with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
Bruker 600MHz DMX600 with a triple resonance cryogenic probehead | Bruker | NMR spectrometer for data acquisition | |
TopSpin 3.1 | Bruker | Acquisition and Processing software for NMR experiments | |
Sparky 3.114 | UCSF (T. D. Goddard and D. G. Kneller) | NMR data Analysis software |