Testa Vascular Invasive cancercellers förmåga i zebrafisk (<em> Danio rerio</em>)

Summary

Denna metod använder zebrafisk embryon för att effektivt testa den vaskulära invasiva förmågan hos cancerceller. Fluorescerande cancerceller injiceras i prekardiellt sinus eller gulesäcken utvecklings embryon. Cancercell vaskulär invasion och extravasering bedöms via fluorescensmikroskopi av svansregionen 24-96 timmar senare.

Abstract

Cancer cell vascular invasion and extravasation is a hallmark of metastatic progression. Traditional in vitro models of cancer cell invasion of endothelia typically lack the fluid dynamics that invading cells are otherwise exposed to in vivo. However, in vivo systems such as mouse models, though more physiologically relevant, require longer experimental timescales and present unique challenges associated with monitoring and data analysis. Here we describe a zebrafish assay that seeks to bridge this technical gap by allowing for the rapid assessment of cancer cell vascular invasion and extravasation. The approach involves injecting fluorescent cancer cells into the precardiac sinus of transparent 2-day old zebrafish embryos whose vasculature is marked by a contrasting fluorescent reporter. Following injection, the cancer cells must survive in circulation and subsequently extravasate from vessels into tissues in the caudal region of the embryo. Extravasated cancer cells are efficiently identified and scored in live embryos via fluorescence imaging at a fixed timepoint. This technique can be modified to study intravasation and/or competition amongst a heterogeneous mixture of cancer cells by changing the injection site to the yolk sac. Together, these methods can evaluate a hallmark behavior of cancer cells and help uncover mechanisms indicative of malignant progression to the metastatic phenotype.

Introduction

Metastatisk sjukdom är en viktig orsak till cancer dödlighet och många mekanismer som gör det möjligt för cancercellernas spridning återstår att upptäcka ^en. För att en cancercell att framgångsrikt metastaser, måste det först invadera genom stroma som omger en primärtumör, anger (intravasate) i cirkulationssystemet, överleva i transit, exit (extravasera) från cirkulationen och slutligen skapa en livskraftig koloni vid den avlägsna organ plats ^två. Intravasering och extravasering är därför avgörande steg i metastaserande kaskad, men varje cancercell är inte i sig skicklig på att störa och migrera genom endotel korsningar ^3. I själva verket finns det en serie av unika selektionstryck som omger cancercell vaskulär invasion och processen kan vidare påverkas av en mängd olika endogena och exogena faktorer ^fyra. Av dessa skäl, tekniker som pejlar aggressiva beteende framskridet stadium cancer fokuserar ofta på vascular invasiv förmåga som ett sätt att förutsäga metastatisk spridning.

Olika modellsystem finns för att underlätta studier av cancercellen vaskulär invasion in vitro. Den mest använda in vitro-analyser involverar antingen Transwell-system för att bedöma cancercell migration genom en endotel barriär ⁵ eller elektrisk Cell Substrate Impedans Sensing (ECIS) teknik för att övervaka i realtid störningar i en intakt endotel monolager av cancerceller ^6. Dessa analyser saknar typiskt fluiddynamik och stromala faktorer som annars skulle påverka cancercell bilaga till ett endotel vägg. Denna fråga är något kringgås genom perfusable vaskulära nätverk som uppstår vid 3D kultur endotel med stödjande stromaceller och dessa 3D mikroflödessystem utgör nu i spetsen för nuvarande in vitro alternativ ^7,8. Ändå dessa metoder utelämna robusta mikro av en funktionell cirkulationssystemetoch därför endast delvis ersättning för in vivo-modeller.

Den mest använda in vivo-modell av vaskulär invasion är musen, i vilken experimentella metastaser analyser är vanligen utföras eftersom de inträffar på relativt korta tidsramar och är i allmänhet ett tecken på metastaserande förmåga ^9. Dessa analyser involverar direkt injektion av cancerceller i omlopp och därför modellera slutstadier metastas, nämligen extravasering och cancerceller kolonisering av organ. De experimentella metastas analyser variera beroende på platsen för cancer cellinjektion och organen slutligen analyseras. I det första analystypen, är cancerceller injiceras i svansvenen på möss och cancercellsådd i lungorna övervakas ^10,11. Den andra analysen innefattar att intrakardiella injektioner för att rikta metastaser sådd mot benet mikro ^12-14, men också hjärnan ^15. I den tredje analysen, cancer calnar injiceras i mjälten för att medge kolonisering av levern ^16, medan den fjärde leveransrutt in i halspulsådern bär cancerceller till hjärnan ^17,18. Oberoende av cancercellen leveransmetod, är organ kolonisering accepterade experimentella slutpunkt och bestäms i allmänhet via luminiscens, histologi, eller PCR-baserade tekniker. Trots de fysiologiska fördelarna med att genomföra experimentella metastaser analyser inom en murin värd, dessa experiment kräver fortfarande veckor till månader att slutföra och analysera.

Zebrafisk (Danio rerio) modellen har nyligen dykt upp som ett nytt system för att studera cancer progression ^19,20, och gör det möjligt att bedöma cancercellen vaskulär invasion inom ett funktionellt cirkulationssystemet under en mycket kortare tidsperiod jämfört med möss ^21-24. Metoden utnyttjar en transparent zebrafisk stam som har sin endotel märkta med en grön rev korall fluorescent protein reporter drivs av kdrl promotorn, zebrafisk receptorn för vaskulär endotelial tillväxtfaktor ^25. I analysen, är cancerceller märkta med en röd fluorescerande markör och injicerades i prekardiellt sinus av två dagar gamla embryon. Någonstans mellan 48 till 96 h efter injektionen, kan cancerceller som har invaderat ut ur vaskulaturen och in i det kaudala området av embryon görs effektivt på ett fluorescensmikroskop. Här tillämpar vi tekniken till en panel av vanliga bröstcancercellinjer mänskliga att visa stora skillnader i deras vaskulära invasiva förmåga. Vidare visar vi att ändring av injektionsstället till embryot gulesäcken möjliggör studiet av heterogena cellinteraktioner, såsom cancercellpopulationer kan differentiellt märkta med fluorescerande färgämnen och injiceras i zebrafiskembryon som saknar fluorescerande vaskulaturen. I detta senare analysen, cancerceller som har invaderat gulan och intravasated in i vasculature poängsätts i den kaudala området 24-48 h efter injektion. På grund av effektiviteten och bekvämligheten av denna modell, är zebrafisk alltmer används för att snabbt testa vaskulära invasiva förmågan hos cancerceller i en fysiologisk miljö.

Protocol

Etik uttalande: zebrafisk embryon genererades enligt en godkänd IACUC protokollet. Dessa experiment genomfördes i enlighet med rekommendationerna från Georgetown University Djurvård och användning kommittén. 1. Organisera Embryon för injektion och skapa stamlösningar Generera erforderlig zebrafisk larver för att bedöma cancercell vaskulär invasion. Ställ in parvis eller grupp i tvär parning med Tg (kdrl: grcfp) zn1, mitfa b692, <e…

Representative Results

Här har vi testat den vaskulära invasiva förmåga av vanliga bröstcancercellinjer i en zebrafisk embryo modell (Figur 1). Strikta kriterier användes i scoring extravasering för dessa olika cellinjer, där positiva händelser endast räknades om cancerceller hade klart extravaserat, varvid detta görs främst för att begränsa eventuella falskt positiva som kan uppstå från att göra poäng cellrester. …

Discussion

Denna teknik använder zebrafisk modell för att effektivt testa vaskulära invasiva förmågan hos cancerceller (se figur 1). Här har vi använt tekniken till en panel av bröstcancercellinjer i syfte att tillhandahålla en baslinje på vilken andra forskare då kan bygga sina egna studier (se tabell 1, fig 2 – 3). Observationen att MDA-MB-231-celler lätt invaderat in den kaudala området av zebrafiskembryon skulle göra denna cellinje idealisk för att testa medel s…

Materials

0.05% Trypsin-EDTA	Life Technologies	25300-054
100mm Dishes	Corning Incorporated	3160-100
5 3/4" Disposable Pastur Pipets, borosilicate Glass	Fisher Brand	13-678-20B
60 mm Dish	Corning Incorporated	3160-60
Agarose, Low Melting	Fisher	BP165-25
Agarose, Molecular Grade	Bioline	BIO-41026
Capillary Glass, Standard, 1.2MM x 0.68MM, 4"	A-M Systems, Inc	627000
David Kopf 700C Vertical Pipette Puller	Hofstra Group	3600
DMEM	Life Technologies	11995-065
Electrode Storage Jar, 1.0MM	World Precision Instruments, Inc	E210
Ethyl 3-aminobenzoate methanesulfonate salt (Tricaine, MS-222)	Fluka	A5040
Eyelash Brush	Ted Pella, Inc	113
Fetal Bovine Serum, Heat Inactivated	Omega Scientific	FB-12
Fisherbrand Transfer Pipettes	ThermoFisher Scientific	13-711-7M
Gel Loading Pipet Tips	Fisher Brand	02-707-181
Glass Bottom Dishes (12.0 mm)	ThermoFisher Scientific	150680
Glass Depression Slide	VWR	470005-634
Instant Ocean Salt, Sea Salt	Pentair	IS50
Latex Rubber Bulbs, 2mL, Pack of 72	Heathrow Scientific	HS20622B
SP8 Confocal Microscope	Leica
Micromanipulator	Narishige
Eclipse E600	Nikon
PBS	Life Technologies	10010-023
Penicillin-G Potassium	Fisher Biotech	BP914-100
Petri Plates, 100mm x 15mm	Fisher Brand	FB0875713
Picospritzer II	General Valve Corporation
RPMI 1640 Medium	Life Technologies	11875-093
Streptomycin Sulfate	Fisher Biotech	BP910-50
Vybrant DiI	ThermoFisher Scientific	V22885
Vybrant DiO	ThermoFisher Scientific	V22886
Zebrafish	Georgetown Zebrafish Shared Resources
Cell lines were maintained in DMEM + 10% FBS, with the expection of BT-474 and HCC18-6 cells, which were mantained in RPMI + 10% FBS.