Une méthode efficace pour l'isolement de l'ARN hautement purifiées de semences pour une utilisation dans quantitative transcriptome Analyse

Résumé

Nous avons réussi à établir une méthode d’isolement de l’ARN à partir de graines de plantes contenant de grandes quantités d’huiles, de protéines et de polyphénols, qui ont des effets inhibiteurs sur l’isolement d’ARN de haute pureté. Notre méthode est adaptée au suivi de l’expression de gènes avec des transcrits de faible niveau dans les graines.

Résumé

Les graines de plantes accumulent de grandes quantités de réserves de stockage composées de matière organique biodégradable. Les humains dépendent des réserves de stockage de graines pour se nourrir et comme matériaux industriels. Les profils d’expression génique sont des outils puissants pour étudier la régulation métabolique dans les cellules végétales. Par conséquent, des profils d’expression génique détaillés et précis pendant le développement des semences sont nécessaires pour la sélection des cultures. L’acquisition d’ARN hautement purifié est essentielle à la production de ces profils. Des méthodes efficaces sont nécessaires pour isoler l’ARN hautement purifié des graines. Ici, nous décrivons une méthode pour isoler l’ARN de graines contenant de grandes quantités d’huiles, de protéines et de polyphénols, qui ont des effets inhibiteurs sur l’isolement d’ARN de haute pureté. Notre méthode permet d’obtenir de l’ARN hautement purifié à partir de graines sans utiliser de phénol, de chloroforme ou de procédés supplémentaires pour la purification de l’ARN. Cette méthode est applicable aux graines d’Arabidopsis, de colza et de soja. Notre méthode sera utile pour suivre les profils d’expression des transcrits de faible niveau dans les graines en développement et matures.

Introduction

Les plantes produisent des graines, qui donnent naissance à la prochaine génération. Graines accumulent de grandes quantités de réserves de stockage, tels que des huiles, des glucides et des protéines, pour la croissance post-germinative. Les humains utilisent les semences des réserves de stockage en tant que sources d'alimentation humaine et animale, et donc des graines de plantes sont l'un des principaux fournisseurs de la matière organique comestible dans le monde entier. L'augmentation des rendements de semences est un défi important dans la science des plantes.

Puisque les réserves de stockage des semences sont des source....

Protocole

1. Extraction de l'ARN total à partir de graines végétales

1. Préparer des ensembles de tampons, des colonnes de spin, 1,5 et 2,0 ml tubes en polypropylène, et des tubes de 1,5 mL polypropylène sans nucléase.
2. Ajouter 1% (p / v) de polyvinylpyrrolidone de grade biologie moléculaire (appelé ci-après PVP) à la cellule tampon de lyse pour extraction d'ARN et vortexer vigoureusement. Incuber pendant 20 min à 25 ° C pour dissoudre complètement. Au bout de 20 minutes d'incubation, mélanger doucement le tampon en faisant tourner le tube à l'envers pour empêcher la formation de bulles. Stocker à température ambiante (15-25 ° C) avant utilisat....

Résultats

Nous avons d' abord étudié la concentration optimale de PVP à l' aide de graines matures Arabidopsis. L'ARN total a été isolé à partir d'environ 1000 graines selon le protocole décrit ci-dessus en utilisant un tampon de lyse cellulaire contenant 0%, 0,25%, 0,5%, 1,0% ou 2,0% de PVP. Après homogénéisation et centrifugation, le surnageant a été recueilli , tout en évitant la couche d'huile et des débris de graines (figure 1A).

Discussion

les profils d'expression des gènes contribuent à notre compréhension de la physiologie des plantes; Par conséquent, les méthodes d'isolement d'ARN spécifiques ont été développés pour chaque condition échantillon ^9-12. Nous avons étudié les processus qui ont été inhibée lors de l'isolement de l'ARN à partir de graines et ont trouvé que la liaison ARN aux membranes de silice a été sévèrement inhibée. De grandes quantités d'huile, les protéines et les polyphénols inhibent l'isolement .......

Matériaux

Liste des matériaux utilisés dans cet article

Nom	Entreprise	Numéro de catalogue	Commentaires
RNeasy Plant Mini Kit	QIAGEN	74904
polyvinylpyrrolidone	Sigma-Aldrich	P5288-100G
HOMOGÉNÉISATEUR S-303	AS ONE	1-1133-02
NanoDrop Lite	Thermo Scientific	ND-NDL-US-CAN
PrimeScript RT reagent kit (Perfect Real Time)	TAKARA	RR037A
KAPA SYBR Kit qPCR rapide	Kapa biosystems	KK4601