Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
Dal momento che la prima descrizione sistematica delle ghiandole paratiroidi in umano e in diverse altre specie di Sandström nel 1880 1, comprendere il significato di questo piccolo organo endocrino per la fisiologia umana e la malattia ha continuamente migliorato. ghiandole paratiroidee secernono l'ormone paratiroideo (PTH), il principale regolatore del metabolismo del calcio. PTH è anche un ormone importante per l'omeostasi fosfato e turnover osseo 1, 2. Rimozione accidentale o danneggiamento delle paratiroidi durante l'intervento chirurgico al collo è la causa più comune di ipoparatiroidismo, una malattia caratterizzata da bassi livelli di calcio nel sangue, bassi PTH, e fosforo elevati 1.
Per una migliore studio acquisito ipoparatiroidismo e nuove terapie di prova, affidabili e facilmente sono necessari modelli di mouse accessibili. I topi sono ampiamente utilizzati nella ricerca perché una grande varietà di strumenti genetici sono unvailable in questa specie che permettono sofisticati studi meccanicistici in vivo. Tuttavia, mentre paratiroidectomia chirurgica (PTX) può essere utilizzato in ratti 2, 3, 4, 5, e mammiferi superiore 6, 7, 8, è tecnicamente molto impegnativo in topi a causa delle piccole dimensioni delle ghiandole e la loro distribuzione anatomica variabile 9. Pertanto, tiro-paratiroidectomia (TPTX) viene in genere eseguita in topi, in cui la tiroide e paratiroidi vengono rimossi insieme 10. Tuttavia, i bassi livelli di ormone tiroideo sono un potenziale fattore confondente in esperimenti, complicando questo modello. Inoltre, cellule C all'interno della ghiandola tiroidea, che producono calcitonina, un ormone importante nella omeostasi del calcio nei roditori, sono anche perso dopo la rimozione dei thyroids 11.
Diversi modelli genetici murini di ipoparatiroidismo esistono, che includono il mouse PTH-null 12, il mouse GCM2-null 13, e il mouse Nuf con una mutazione attivante del recettore sensibile al calcio (CaSR) 14, 15. Tuttavia, questi difetti genetici sono già presenti durante lo sviluppo embrionale, e la funzione delle paratiroidi è quindi già alterata durante l'embriogenesi. Questo può influenzare lo sviluppo di organi, come lo scheletro. Questo contrasta con i pazienti con ipoparatiroidismo post-chirurgica che acquisiscono la malattia più tardi nella vita. Inoltre, alcuni di questi modelli di topo esibiscono mortalità precoce e riduzione della fertilità, il che complica ulteriormente il loro uso 12, 13, 14.
Abbiamo sviluppato due nuovo mouse modelli per ipoparatiroidismo acquisito. Utilizzando topi geneticamente ingegnerizzati che esprimono GFP in particolare nelle paratiroidi permette alle ghiandole paratiroidee per essere facilmente identificati per la rimozione chirurgica senza rimuovere la ghiandola tiroidea. Questo mouse è stato generato attraversando il mouse PTH-Cre, che esprime Cre ricombinasi sotto il controllo del promotore 5,5 kb PTH 16 con il mouse ROSA mTmG. I PTHcre risultanti; topi mTmG esprimono la proteina fluorescente verde specificamente in cellule paratiroidee. Il secondo modello di topo utilizza lo stesso PTH-Cre, questa volta per rimuovere una cassetta di STOP dal mouse inducibile DTR, con conseguente espressione del recettore tossina difterica specifico nelle paratiroidi. La somministrazione sistemica di DT distrugge le cellule paratiroidee, rendendo gli animali hypoparathyroid senza intervento chirurgico.
I due modelli di mouse presentati in questo studio dimostrano un fenotipo hypocalcemic stabile negli peri di osservazione a tre mesiod. Le procedure sono facili da eseguire, il fenotipo è riproducibile, ed i topi hypoparathyroid presentano un alto tasso di sopravvivenza 17.
Dimostriamo la tecnica della paratiroidectomia GFP-guidato utilizzando topi transgenici con espressione GFP selettivamente nelle ghiandole paratiroidi. Nei PTHcre; topi mTmG, il doppio di fluorescenza (GFP verde nelle cellule Cre-espresse e rosso pomodoro in non-Cre espresso cellule) ci ha permesso di identificare con chiarezza, e di rimuovere con precisione tutte le ghiandole paratiroidee senza rimuovere le tiroide. Mentre noi preferiamo l'uso dei topi mTmG doppio fluorescenza per la capacità di identificare il tessuto non paratiroideo rosso fluorescente, la nostra procedura dovrebbe funzionare bene anche con gli animali fluorescenti singoli, come il rosso del pomodoro (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) HZE / J) del mouse. La procedura è relativamente facile da eseguire, richiede circa 20 minuti per topo, e si traduce in una grave e sostenuta fenotipo hypoparathyroid.
Inoltre, un altro vantaggio delle ghiandole paratiroidee GFP-positive è la facilità di rilevazione delle ghiandole paratiroidee aberranti. I nostri studi dimostranomislocalization delle paratiroidi in circa un quarto di topi B6 (Figura 1), che vengono facilmente rilevati nel nostro modello di topo dalla fluorescenza verde. Contrariamente a tiro-paratiroidectomia, la nostra tecnica evita la rimozione della tiroide con conseguente necessità di sostituzione dell'ormone tiroideo e l'effetto sconosciuta di rimozione della tiroide cellule C calcitonina produttrici. ghiandole paratiroidee fluorescente potrebbero essere utilizzati anche per altre indagini che richiedono l'isolamento delle ghiandole paratiroidee. La limitazione di questo modello include il requisito per la chirurgia. sono richieste competenze microchirurgia base e un microscopio dissezione con una sorgente luminosa fluorescente.
è dimostrata Una seconda tecnica per generare topi hypoparathyroid che elimina la necessità di un intervento chirurgico. Tossina difterica-topi trattati PTHcre-IDTR mostrano una lieve ipoparatiroidismo fenotipo, ma richiedono semplicemente l'iniezione di DT per via intraperitoneale nel mouse. La parte critica FOR generando questo modello è stato l'ottimizzazione della dose e regime di dosaggio. Alte dosi di DT ha portato alla tossicità ma basse dosi diminuito l'efficacia di questo approccio. Abbiamo determinato che il reggimento dose di 2 iniezioni a 5 mg / kg, somministrata 3 giorni di distanza, ha provocato ipocalcemia affidabile e stabile senza / minimo la mortalità.
In definitiva, ci auguriamo che questi due approcci forniscono modelli utili del mouse per ipoparatiroidismo acquisito. Utilizzando un romanzo PTH lunga durata d'azione, abbiamo riportato il primo uso di entrambi questi modelli nel determinare l'efficacia di nuovi farmaci per ipoparatiroidismo 17.
The authors have nothing to disclose.
Questo lavoro è stato supportato dal NIH concede R01-DK100584 e Cina Stato chiave Laboratorio di malattie orali aperta finanziamento SKLOD2015OF01 (RB). Ringraziamo Wenping Zhao, Tadatoshi Sato, e Kelly Lauter aiuto.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |