Mice with acquired hypoparathyroidism would be useful for studying novel drug therapies for hypoparathyroidism. Two procedures to create such mice are demonstrated. The GFP-PTX mouse is generated by surgical parathyroidectomy guided by green fluorescing parathyroid glands. A second, non-surgical approach is based on parathyroid-specific expression of the diphtheria toxin receptor.
Hypoparathyroidism (HP) is a disorder characterized by low levels of PTH which lead to hypocalcemia, hyperphosphatemia, and low bone turnover. The most common cause of the disease is accidental removal of the parathyroid glands during thyroid surgery. Novel therapies for HP are needed, but testing them requires reliable animal models of acquired HP.
Here, we demonstrate the generation of two mouse models of acquired HP. In the GFP-PTX model, mice with green fluorescent protein (GFP) expressed specifically in the parathyroids (PTHcre-mTmG) were created by crossing PTHcre+ mice with Rosa-mTmGfl/fl mice. Green fluorescing parathyroid glands are easily identified under a fluorescence dissecting microscope and parathyroidectomy is performed in less than 20 min. After fluorescence-guided surgery, mice are profoundly hypocalcemic. Contrary to the traditional thyro-parathyroidectomy, this precise surgical approach leaves thyroid glands and thyroid function intact. The second model, which does not require surgery, is based on a diphtheria-toxin approach. PTHcre-iDTR mice, which express the diphtheria toxin (DT) receptor specifically in the parathyroids, were generated by crossing the inducible DTR mouse with the PTHcre mouse. Parathyroid cells are thus rendered sensitive to diphtheria toxin (DT) and can be selectively destroyed by systemically injecting mice with DT. The resulting hypocalcemic phenotype is stable.
С момента первого систематического описания паращитовидных желез у человека и в нескольких других видов Сандстрёма в 1880 году 1, понимая значение этого маленького эндокринного органа по физиологии человека и болезней постоянно совершенствуется. Паращитовидных желез секреции паратиреоидного гормона (РТН), главный регулятор метаболизма кальция. PTH также является важным гормоном для фосфатного гомеостаза и метаболизма костной ткани 1, 2. Случайное удаление или повреждение паращитовидных желез во время операции шеи является наиболее распространенной причиной гипопаратиреоз, болезнь характеризуется низким содержанием кальция в крови, низкий уровень ПТГ и повышенных фосфора 1.
Для лучшего изучения приобретенного гипопаратиреоз и тестирования новых методов лечения, надежные и легко доступные модели мыши обязательны к заполнению. Мыши широко используются в исследованиях, поскольку большое разнообразие генетических инструментов являютсяв этой модели шириной вида , разрешающих сложные механистические исследования в естественных условиях. Тем не менее, в то время как хирургическое паратиреоидэктомия (PTX) может быть использован у крыс 2, 3, 4, 5, и более крупных млекопитающих , 6, 7, 8, это технически очень сложно у мышей из – за небольшого размера желез и их переменной анатомического распределения 9. Таким образом, Thyro-паратиреоидэктомия (TPTX) обычно проводят на мышах, в которых щитовидная и паращитовидные железы удаляются вместе 10. Тем не менее, низкий уровень гормонов щитовидной железы являются потенциальным confounder в экспериментах, усложняя эту модель. Кроме того, C-клеток в щитовидной железе, которые производят кальцитонин, гормон важно в кальциевого гомеостаза у грызунов, также теряются при удалении из гоyroids 11.
Несколько генетические модели мыши гипопаратиреозом существуют, которые включают в себя РТН-нуль мышь 12, GCM2-нуль мышь 13 и мышь Нуф с мутацией активирующего в кальция зондирования рецептор (CASR) 14, 15. Тем не менее, эти генетические дефекты уже присутствуют во время эмбрионального развития, и функция паращитовидных желез, следовательно, уже нарушена в процессе эмбриогенеза. Это может повлиять на развитие органов, таких как скелет. Это контрастирует с пациентами с послеоперационным гипопаратиреоз, приобретающих болезнь позже в жизни. Кроме того, некоторые из этих моделей мыши обладают ранней летальности и снижение рождаемости, что еще больше затрудняет их использование 12, 13, 14.
Мы разработали две новые мыши мodels учтенные гипопаратиреоз. С помощью генной инженерии мышей, которые выражают GFP в частности паращитовидных желез позволяет паращитовидных желез быть легко идентифицированы для хирургического удаления без удаления щитовидной железы. Эта мышь была сгенерирована путем скрещивания мыши РТН-Cre, выражающий Cre рекомбиназу под контролем 5,5 т.п.н. РТН промотора 16 с помощью мыши РОСА mTmG. Полученные PTHcre; мышей mTmG выражают зеленый флуоресцентный белок специфически в клетках паращитовидной железы. Вторая модель мыши использует тот же РТН-Cre, на этот раз с требованием удалить СТОП кассету из индуцируемого DTR мыши, что приводит к экспрессии рецептора дифтерийного токсина специфически в паращитовидных желез. Системное введение DT разрушает клетки паращитовидной железы, что делает животных hypoparathyroid без хирургического вмешательства.
Две мышиные модели, представленные в данном исследовании, демонстрируют устойчивую hypocalcemic фенотип над пери наблюдения трехмесячныхобмундирование оливково-серого цвета Процедуры просты для выполнения, фенотип является воспроизводимым, а hypoparathyroid мыши обнаруживают высокую скорость 17 выживания.
Мы демонстрируем технику GFP наведением паратиреоидэктомии с использованием трансгенных мышей с экспрессией GFP избирательно в паращитовидных желез. В PTHcre, мышей mTmG, двойной флуоресценции (зеленая GFP в Cre-выраженных клеток и красный помидор в не-Cre выражены клетки) позволили нам четко определить и точно удалить все паращитовидных желез без удаления щитовидной железе. В то время как мы предпочитаем использовать двойной флуоресценции мышей mTmG для способности идентифицировать флуоресцентный красный без паращитовидной ткани, наша процедура должна также хорошо работать с использованием одиночных флуоресцентных животных, таких как томатный красный (B6.Cg-Ct (ROSA) 26Sortm14 ( CAG-tdTomato) Hze / J) мыши. Процедура относительно легко выполнить, требует около 20 минут на мышь, и приводит к тяжелым и устойчивым hypoparathyroid фенотипа.
Кроме того, еще одним преимуществом GFP-положительных паращитовидных желез является легкость обнаружения аберрантных паращитовидных желез. Наши исследования показывают,mislocalization из паращитовидных желез в около четверти мышей В6 (рис 1), которые легко обнаружить в нашей модели мыши с помощью зеленой флуоресценции. В отличие от Thyro-паратиреоидэктомии, наш метод позволяет избежать удаления щитовидной с последующей необходимости замены тиреоидных гормонов и неизвестному эффект удаления кальцитонина продуцирующих тиреоидных С-клеток. Флуоресцентно меченных паращитовидных желез могут быть также использованы для других исследований, которые требуют изоляции паращитовидных желез. Ограничением этой модели включает в себя требование к операции. Базовые навыки микрохирургии и рассечение микроскоп с флуоресцентным источником света требуется.
Второй метод генерирования hypoparathyroid мышей, что устраняет необходимость в операции демонстрируется. Дифтерия токсин обработанных мышей PTHcre-IDTR демонстрируют более мягкое гипопаратиреоз фенотип, но просто требуют инъекции DT внутрибрюшинно в мышь. Критическая часть FOг генерации этой модели была оптимизация дозы и режима дозирования. Высокие дозы DT привели к токсичности, но низкие дозы снижала эффективность подхода. Мы определили, что доза полк 2-х инъекций в 5 мкг / кг, при введении 3 дней друг от друга, привели к надежной и стабильной гипокальциемии, без / минимальной смертности.
В конечном счете, мы надеемся, что эти два подхода дают полезные модели мыши для приобретенной гипопаратиреоз. Используя новый пролонгированный РТН, мы уже сообщали первое использование обоих этих моделей при определении эффективности новых лекарств для гипопаратиреозом 17.
The authors have nothing to disclose.
Эта работа была поддержана NIH гранты R01-DK100584 и Китайская государственная лаборатория заболеваний полости рта Открытое финансирование SKLOD2015OF01 (РБ). Мы благодарим Wenping Чжао, Тадатоси Сато, и Келли Lauter за помощью.
ROSAmT/mG mice | The Jackson Laboratory | 7676 | |
PTH-Cre mice | The Jackson Laboratory | 5989 | |
iDTRmice | The Jackson Laboratory | 7900 | |
6-0 polyglactin 910 suture with needle | Ethicon, Inc | J510G | |
Safety Single Edge Razor Blades | American Safety Razor Company | 66-0089 | |
Disposable Scalpel | Feather Safety Razor Co., LTD | 72042-11 | |
Povidone-Iodine Prep Pads | Dynarex Corporation | 1108 | |
Ply gauze | Busse. Inc | BHD707 | |
0.9% Sodium Chloride Solution | HOSPIRA Worldwide, Inc | 07983-09 | |
1mL 29G Insulin Syringe | BECTON DICKINSON | 329622 | |
Surgical Incise Drapes | 3M | 6640EZ | |
Dumstar Biology forceps | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-4984 | |
Micro Dissecting Spring Scissors | Roboz Surgical Instrument Co., Inc | RS-5605 | |
Needle Holder | MILTEX.,Inc | V98-42 | |
2,2,2-Tribromethanol | Sigma-Aldrich | T48402 | |
2-Methyl-2-Butanol | Sigma-Aldrich | 152463 | For dissolve the 2,2,2-Tribromethanol |
Diphtheria Toxin Powder | Sigma-Aldrich | D0564 | Dissolve in 0.9% sodium chloride solution at 1mg/mL as the stock solution in -80C |
Multicap Blood Collection Capillary tubes | Siemens Healthcare Diagnostics Ltd | 855578 | For collecting blood in iCa2+ analysis using RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer |
RapidLab 348 Ca2+/pH analyzer | Siemens Healthcare | For iCa2+ analysis |