Magnetische levitatie In combinatie met Portable Imaging and Analysis for Disease Diagnostics

Summary

We present a magnetic levitation technique coupled with automated imaging and analysis in both a smartphone-compatible device and a device with embedded imaging and processing. This is applied to measure the density distribution of cells with two demonstrated biomedical applications: sickle cell disease diagnosis and separating white and red blood cells.

Abstract

Currently, many clinical diagnostic procedures are complex, costly, inefficient, and inaccessible to a large population in the world. The requirements for specialized equipment and trained personnel require that many diagnostic tests be performed at remote, centralized clinical laboratories. Magnetic levitation is a simple yet powerful technique and can be applied to levitate cells, which are suspended in a paramagnetic solution and placed in a magnetic field, at a position determined by equilibrium between a magnetic force and a buoyancy force. Here, we present a versatile platform technology designed for point-of-care diagnostics which uses magnetic levitation coupled to microscopic imaging and automated analysis to determine the density distribution of a patient’s cells as a useful diagnostic indicator. We present two platforms operating on this principle: (i) a smartphone-compatible version of the technology, where the built-in smartphone camera is used to image cells in the magnetic field and a smartphone application processes the images and to measures the density distribution of the cells and (ii) a self-contained version where a camera board is used to capture images and an embedded processing unit with attached thin-film-transistor (TFT) screen measures and displays the results. Demonstrated applications include: (i) measuring the altered distribution of a cell population with a disease phenotype compared to a healthy phenotype, which is applied to sickle cell disease diagnosis, and (ii) separation of different cell types based on their characteristic densities, which is applied to separate white blood cells from red blood cells for white blood cell cytometry. These applications, as well as future extensions of the essential density-based measurements enabled by this portable, user-friendly platform technology, will significantly enhance disease diagnostic capabilities at the point of care.

Introduction

Hier presenteren we een technologieplatform en een techniek die magnetische levitatie combinatie met geautomatiseerde beeldvorming en analyse gebruikt om de dichtheidsverdeling van cellen van een patiënt te analyseren als indicator voor de ziekte. Deze veelzijdige benadering dichtheid gebaseerde cytometrische analyse kan uiteindelijk worden toegepast op een reeks van diagnostiek. Om echter verenigbaar met point-of-care testen en gebruik in ontwikkelingslanden, moet de techniek vereisten voor goedkope, draagbaarheid en bruikbaarheid voldoen. Het apparaat en verbruiksgoederen moet gemakkelijk worden verkregen tegen een lage kostprijs. Het monster voorbereiding moet eenvoudig zijn, moet de analyse worden geautomatiseerd met minimale eisen voor de invoer van de gebruiker of de interpretatie, en de resultaten moeten snel worden geretourneerd. Verder moet het apparaat compact en draagbaar bruikbaar in klinische en ontwikkelingslanden te zijn. Zo hebben wij een inrichting en werkwijze ontwikkeld magnetische levitatie gebruiken point-of-care-compatibele technolgie door koppeling geautomatiseerde beeldvorming en analyse resultaten betreffende de verdeling densiteit van een populatie van cellen van een patiënt.

Point-of-care technologieën bieden een opmerkelijk voordeel ten opzichte van de huidige klinische laboratoriumtests procedures. De technologie die momenteel beschikbaar is te duur om te worden bezeten door een arts of te complex uitgevoerd door medisch personeel worden uitgevoerd. Veel van deze procedures vereisen arbeidsintensieve protocollen die door een vakman moeten worden uitgevoerd. Daarom worden patiënten monsters zoals bloed of urine in het algemeen opgevangen in de dokterspraktijk vervolgens overgebracht naar een externe, gecentraliseerde testlaboratorium voor klinische testen, die verscheidene dagen duren voordat de arts om de resultaten van de test te ontvangen. Dit kan vertragingen of complicaties tijdens behandeling in sommige gevallen veroorzaken, maakt deze tests zeer kostbaar en inefficiënt (waardoor een financiële last op de verzekering betalers), en verder maakt veeldiagnostiek ontoegankelijke in low-resource-instellingen en de ontwikkelingslanden.

Hier presenteren we een magnetische levitatie techniek in combinatie met geautomatiseerde beeldvorming en analyse zowel een inrichting met ingebedde beeldvorming en verwerking (figuur 1) en een smartphone-compatibel apparaat (figuur 2). Deze magnetische levitatie-gebaseerde apparaten vormen een breed toepasbare platform technologie die het mogelijk moet worden toegepast op een reeks van verschillende medische diagnostische toepassingen. De magnetische levitatie benadering van enerzijds een evenwicht tussen twee krachten: een magnetische kracht en drijfvermogen ^{1, 2, 3.} Wanneer een deeltje gesuspendeerd in een paramagnetisch medium en in een magnetisch veld dat door twee magneten met gelijke polen tegenover elkaar, een magnetische kracht werkt op het deeltje in de richting van de hartlijn tussen de twee magn ingevoegd ets. Het drijfvermogen wordt veroorzaakt door de relatieve dichtheid van de deeltjes ten opzichte van het suspenderende medium en opwaarts in het geval van deeltjes minder dicht dan het medium en neer bij deeltjes dichter dan het omringende medium. Op basis van deze twee krachten, zullen deeltjes een evenwicht levitatie in het domein waarin deze twee krachten in evenwicht te bereiken; deze positie is direct gerelateerd aan de dichtheid van het deeltje, met dichtere deeltjes zweven lager in het gebied van minder dichte deeltjes. Een beeldvormende module, hetzij een ingebouwde camera smartphone ^{4, 5, 6} of onafhankelijke optische componenten voorzien van een vergrotende lens ^{7, 8,} worden gebruikt om de posities van de deeltjes zichtbaar. Beeldverwerking, hetzij door middel van een smartphone applicatie ^{4, 5,}= "xref"> 6 of een ingebedde verwerkingseenheid ^{7, 8,} verwerkt vervolgens de opgenomen beelden op de ruimtelijke verdeling kwantificeren en derhalve de verdeling van de dichtheid bevolking. Om grotere monsters (zoals die met slechts enkele deeltjes per milliliter plaats te analyseren, kan de telefoon rechtstreeks worden geïntegreerd in de inrichting, de deeltjes zweven en geanalyseerd zoals deze door het beeldgebied passen (figuur 2).

Figuur 1: Onafhankelijk magnetische levitatie Platform. (A) Compacte magnetische levitatie inrichting een magnetische module richten, imaging componenten (a light-emitting diode (LED), een optische lens en een camera detector) en een verwerkingseenheid met een beeldscherm. (B) De magnetische veldsterkte in de cross gedeelte van het gebied tussen de magneten waar het monster wordt aangebracht. De veldsterkte het grootst aan het oppervlak van de magneten en nul benadert bij de middellijn tussen hen. (C) Deeltjes, zoals cellen, in het magneetveld zijn verscheidene krachten: een magnetische kracht (F _m) naar de middellijn tussen het magnetisme, met een kracht variërend op basis van de positie van het deeltje; een zwaartekracht _(Fg) die afhangt van de deeltjesdichtheid ten opzichte van die van het suspenderende medium en een sleepkracht _(Fd) verzet tegen de beweging van de deeltjes. Gereproduceerd, met toestemming, uit Yenilmez, et al. ⁸ Klik hier voor een grotere versie van deze figuur te bekijken.

vijgure 2: Smartphone-compatibele Flow-geassisteerde magnetische levitatie Platform. (A – c) Voor (a), de zijkant (b), en terug (c) standpunten van magnetische levitatie apparaat (d) De onderdelen van het toestel zijn onder meer: 1) magnetische levitatie module, met inbegrip van permanente magneten, een vergrootglas, en een LED en lichte diffuser, 2) smartphone geval, 3) elektronica, met inbegrip van een microcontroller, pomp driver en Bluetooth-ontvanger, 4) houder micro-pomp, 5) instelbare opening, 6) afval buis houder, 7) batterijhouder, 8 ) monsterhouder, 9) dual-purpose stand en deksel. (E) Flow schema, waarin pompen van het monster door het magnetische veld. (F) Doorsnede van de magnetische levitatie module toont hoe deeltjes met verschillende dichtheden wordt uitgelijnd als ze door de velden worden gepompt; minder dichte deeltjes, zoals Deeltje 1, zal evenwicht bij hogere levitatie hoogte than dichtere deeltjes, zoals Particle 2. Overgenomen, met toestemming, van Amin, et al. ¹ Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.

De minimale voorgeschreven om een ​​monster voor dichtheidsverdeling analyse in dit systeem zijn de mogelijkheid om een ​​suspensie van cellen of deeltjes groter dan ongeveer 5 urn en minder dan ongeveer 250 urn in grootte (voor beeldvorming en beeldverwerking) en de verenigbaarheid ervan met krijgen mengen in een oplossing van een paramagnetische oplossing zoals gadobutrol hier gebruikt. Voor diagnostiek, compatibele toepassingen omvatten die waarin (i) cellen plaats inherent een veranderde densiteit als ze dragen een ziekte vergeleken met gezonde controles, (ii) een verandering van dichtheid in de cel worden geïnduceerd door toevoeging van een reagens of een alternatieve behandeling voor een kortcubation tijd, of (iii) verschillende celtypen worden geïdentificeerd in een enkel monster en intrinsiek (of via enige vorm van behandeling) hebben unieke eigenschap dichtheden.

Sikkelcelanemie is een genetische aandoening veroorzaakt een gemuteerde vorm van hemoglobine, HbS, worden geproduceerd in iemands rode bloedcellen (RBC's), die kan leiden tot onregelmatige vaso-occlusieve gebeurtenissen en chronische hemolytische anemie ^9. Het is gediagnosticeerd met behulp van hemoglobine iso-elektrische focussering, high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) fractionering, of hemoglobine elektroforese die zeer nauwkeurig zijn, maar moet worden uitgevoerd in een klinisch laboratorium, omdat zij onverenigbaar zijn met point-of-care-instellingen. Oplosbaarheid en op papier gebaseerde tests voor sikkelcelziekte zijn voorgesteld, maar over het algemeen vereisen subjectief gebruiker interpretatie en bevestigende testen. Hier gebruiken we een dichtheid gebaseerde benadering van sikkel RBC's te identificeren, die een hogere dichtheid dan RB bereikenCs van mensen zonder sikkelcelziekte. Het mechanisme omvat polymerisatie van de gemuteerde vorm van hemoglobine, HbS, waarin RBC uitdroging veroorzaakt bij sikkelcelziekte RBCs onder zuurstofarme omstandigheden ^{10, 11, 12, 13.}

Deze benadering dichtheid gebaseerde kan ook worden toegepast op cellen van verschillende soorten gescheiden op basis van de dichtheid: witte bloedcellen (WBC's) en RBC ^7. WBC's zijn over het algemeen verantwoordelijk zijn voor het bestrijden van infecties in het lichaam. WBC cytometrie kan worden gebruikt om het aantal van deze cellen in het bloed te kwantificeren en dient als een nuttig diagnostisch instrument. WBC telt hoger dan normaal (algemeen beschouwd als meer dan 11.000 cellen per pl) kan infectie, aandoeningen van het immuunsysteem, of leukemie te geven. WBC tellingen lager dan normaal (ongeveer 3500 cellen per ui) worden veroorzaakt door auto-immuunstoornissen of conditionen die schade beenmerg. In tegenstelling tot alternatieve technologieën, heeft het proces hier gepresenteerde geen beroep doen op lysis van de rode bloedcellen of vlekken om WBC's te identificeren. Deze celgebaseerde proef maakt gebruik van de unieke inherente dichtheden van de twee celtypen te scheiden voeren, als WBC bevolkingsdichtheid gerapporteerd lager dan die van de RBC bevolking eerder berekend met dichtheidsgradiënt centrifugatie ^{2, 3} te zijn.

Tegenover alterative testen op afgelegen plaatsen, deze test is een snelle, eenvoudige monstervoorbereiding (figuur 3), scheiding van cellen in de inrichting binnen 10 – 15 min, en geautomatiseerde beeldvorming en analyse die minder dan 1 minuut nodig. Op deze wijze kan de inrichting resultaten snel naar medische beslissingen beter te informeren, zodat behandeling onmiddellijk te worden toegediend aan fysieke en psychologische pijn te verlichten, en het risico op complicaties verminderen Associated met een vertraging in de medische zorg. Deze techniek kan worden uitgevoerd op locatie of in klinische settings door eenvoudige monstervoorbereiding en geautomatiseerde beeldvorming en analyse die een resultaat met minimale gebruikersinvoer of interpretatie geeft. Door het gebruik van een eenvoudige benadering gebruiken permanente magneten voor monsteranalyse en het gebruik van hetzij een smartphone of eenvoudige elektrische componenten voor beeldvorming en beeldverwerking, het apparaat en de kosten per test zijn minimaal in vergelijking met enkele geavanceerde testprocedures.

Protocol

Ethische verklaring: Alle procedures met menselijke bloedmonsters werden volgens de institutionele voorschriften uitgevoerd. Alle protocollen zijn beoordeeld en goedgekeurd door de Institutional Review Board goedgekeurd. Een geïnformeerde toestemming werd gegeven door alle deelnemers. 1. Monstervoorbereiding voor sikkelcelziekte Diagnose 5, 8 Bereid een 50 mM oplossing van gadobutrol in Hank's Balanced Salt Solution (…

Representative Results

Celdichtheid distributieanalyse, de techniek die voor sikkelcelziekte diagnose, het doel is de breedte van de verdeling van de celpopulatie te identificeren. Bloedcellen van patiënten zonder sikkelcelanemie wordt ingesloten in een voorspelbare breedte. Cellen van patiënten met sikkelcelziekte wordt verdeeld over een groter gebied, met een neerwaartse scheve in de celverdeling (zie figuur 4) Voor een bepaalde toepassing kan een drempel worden ingesteld tussen de verdeli…

Discussion

Kritische stappen in het protocol
Kritische factoren in dit proces zijn de juiste uitlijning van de magneten. Als de magneten verdreven worden of gescheiden meer dan normaal in het apparaat, kan dit invloed hebben op de resultaten. Te controleren voor deze fout of andere in het proces, een dichtheid gecontroleerde deeltje, zoals polystyreen microbolletjes kunnen worden gebruikt om periodiek te controleren voor veranderingen in de tijd. Verder, levitatie tijd is het belangrijk om de cellen om evenwicht te bereiken…

Materials

Gadavist (Bayer)	Jefferson Medical and Imaging	2068062	Gadavist contains 1M gadobutrol, a chelate of gadolinium. We purchased 2 mL vials with 15/ca.
Square glass microcapillary tubes	Vitrocom	8270	50 mm length is sufficient
Sodium metabisulfite	Sigma-Aldrich	S9000	Chemical formula: Na2S2O5
Leica Microsystems Critoseal tube sealant	Fisher Scientific	02-676-20
Hank's Balanced Salt Solution	Sigma-Aldrich	H9269 SIGMA
Trypsin-EDTA	Sigma-Aldrich	T4049	Or other reagent as recommended for the cell type used
MICROLET 2 Adjustable Lancing Device	Walgreens	246567	Any lancing device is acceptable when used according to biosafety protocols
Microlet Lancets	Walgreens	667474	Must be dispoable and not reused
Hausser Bright-Line Phase Hemacytometer	Fisher Scientific	02-671-6	Or any preferred method for cell counting
ACK Lysing Buffer	ThermoFisher	A1049201