इस प्रोटोकॉल इन विट्रो में भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य पीढ़ी और मानव प्रेरित विनियामक टी कोशिकाओं (iTregs) की phenotyping वर्णन करता है। Foxp3 शामिल करने के लिए अलग अलग प्रोटोकॉल संबंधित प्रोटोकॉल के साथ प्राप्त विशिष्ट iTreg phenotypes के अध्ययन के लिए अनुमति देते हैं।
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
सीडी 4 + CD25 + Foxp3 + विनियामक टी कोशिकाओं (Tregs) अन्य प्रतिरक्षा कोशिकाओं को दबाने और परिधीय सहिष्णुता की आलोचना मध्यस्थों, रोकने औतोइम्मुिनित अत्यधिक सूजन 1 रहे हैं। Tregs के महत्व को मानव रोग immunodysregulation polyendocrinopathy enteropathy एक्स से जुड़े सिंड्रोम (IPEX), जो Tregs के नुकसान में `master' Treg प्रतिलेखन कारक forkhead बॉक्स पी 3 में म्यूटेशन के कारण (Foxp3) द्वारा उदाहरण गंभीर प्रणालीगत ऑटोइम्यून रोग होता है, एक कम उम्र में घातक। हालांकि, Tregs प्रतिरक्षा प्रणाली को वे भी कुछ सेटिंग 2 में विरोधी ट्यूमर प्रतिरक्षा को प्रभावित कर सकते हैं के रूप में एक दोधारी तलवार के रूप में काम करते हैं। Treg संख्या और समारोह की चिकित्सीय हेरफेर इसलिए कई चिकित्सीय जांच के अधीन है। कैंसर में, Tregs की कमी वांछनीय हो सकता है और नैदानिक दृष्टिकोण के कुछ सफलता आगे अनुसंधान 3 प्रोत्साहित करती है। स्व-प्रतिरक्षित और भड़काऊ रोगों, seve में Tregs के उपचारात्मक प्रभाव के अलावा मेंRAL माउस रोग मॉडल, हाल ही में पहली बार मैन दत्तक Treg हस्तांतरण के परीक्षण graft- बनाम मेजबान रोग (GVHD) 4 को रोकने के लिए – 7 और इलाज टाइप 1 मधुमेह 8 में सुरक्षा का आकलन करने के लिए बहुत ही होनहार परिणामों से पता चला है।
स्वाभाविक रूप से होने वाली Tregs (nTregs) स्वास्थ्य को बनाए रखने में 9 थाइमिक व्युत्पन्न tTregs और सतही तौर पर प्रेरित pTregs, गैर बेमानी आवश्यक कार्यों के साथ शामिल – 11। हालांकि, nTreg संख्या पूरक भोले टी सेल व्यापारियों 12 से इन विट्रो में उत्प्रेरण Tregs (iTregs) के दृष्टिकोण को प्रोत्साहित करने, सीमित हैं। ITregs की फिर भी स्थिरता, शायद Foxp3 जीन ठिकाना 13 में तथाकथित Treg विशेष demethylated क्षेत्र (TSDR) में demethylation की कमी के कारण, एक चिंता का विषय बनी हुई है और कई अध्ययनों से संकेत मिलता है कि प्रेरित Tregs विवो में और अधिक स्थिर 14 हैं।
तिथि करने के लिए, सबसे अच्छा Foxp3 प्रोटीन मीटर रहता हैTregs के लिए arker लेकिन यह क्योंकि मानव पारंपरिक सीडी 4+ टी कोशिकाओं CD25- क्षणिक सक्रियण 15,16 पर Foxp3 के मध्यवर्ती स्तर व्यक्त बिल्कुल विशिष्ट नहीं है। हालांकि महत्वपूर्ण प्रगति Foxp3 अभिव्यक्ति के नियमन elucidating में किया गया है, बहुत विशेष रूप से मानव कोशिकाओं में प्रेरण, स्थिरता और Foxp3 के समारोह के बारे में पता चला जाना बना रहता है। NTregs करने के लिए मतभेदों के बावजूद, इन विट्रो में प्रेरित Foxp3 + सीडी 4+ टी कोशिकाओं Foxp3 प्रेरण के आणविक तंत्र का अध्ययन करने के लिए एक मॉडल प्रणाली के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है और भविष्य में प्रोटोकॉल है कि iTregs की पीढ़ी के लिए अनुमति देते हैं कि अधिक में करने के लिए इसी तरह की हैं विकसित करने के लिए एक प्रारंभिक बिंदु के रूप में उत्पन्न Tregs, जो भविष्य में दत्तक हस्तांतरण रणनीतियों के लिए लागू किया जा सकता है विवो।
इसमें कोई `सोने standard' मानव iTregs प्रेरित करने के लिए प्रोटोकॉल है, और मौजूदा प्रोटोकॉल विवो में Treg उत्प्रेरण की स्थिति नकल उतार के आधार पर विकसित किया गया है: 2 (आईएल -2 इंटरल्यूकिन) और बदलने वृद्धि कारक β (TGF-β) संकेतन विवो 17 में Foxp3 शामिल करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, और सब पार retinoic एसिड (ATRA) – जो विवो में पेट से जुड़े वृक्ष के समान कोशिकाओं द्वारा निर्मित है – बार-बार Foxp3 प्रेरण को बढ़ाने के लिए प्रयोग किया जाता है 21 – 18 विट्रो में। हम अतिरिक्त मानव Treg उत्प्रेरण butyrate 22, एक पेट microbiota व्युत्पन्न लघु श्रृंखला फैटी एसिड है कि हाल ही में murine Treg प्रेरण 23,24 बढ़ाने के लिए दिखाया गया था का उपयोग कर प्रोटोकॉल विकसित किया है। हम यह भी हाल ही में TGF-β, ATRA के संयोजन का उपयोग और 22 rapamycin, बाद rapamycin (mTOR) के एक चिकित्सकीय अनुमोदित स्तनधारी लक्ष्य जा रहा है कि अवरोध को बढ़ावा देने के लिए जाना जाता है के द्वारा इन विट्रो में बेहतर दमनकारी समारोह के साथ iTregs की पीढ़ी के लिए एक नए प्रोटोकॉल स्थापित मानव Treg विस्तार 25,26 दौरान Foxp3 रखरखाव।
इस विधि में प्रतिलिपि प्रस्तुत करने का वर्णनमानव सीडी 4 + Foxp3 + विभिन्न शर्तों का एक सेट का उपयोग कर iTregs, और फ्लो और मात्रात्मक रिवर्स प्रतिलेखन पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन द्वारा उनके बाद phenotyping के इन विट्रो पीढ़ी (QRT- पीसीआर) Foxp3 की अभिव्यक्ति और अन्य Treg हस्ताक्षर अणुओं इस तरह के प्रोटोकॉल-विशिष्ट पैटर्न प्रकट करने के लिए CD25, CTLA -4, EOS, साथ ही IFN-γ और SATB1 अभिव्यक्ति 22 के दमन के रूप में। उत्पन्न सेल आबादी दमनकारी गतिविधि के बारे में कार्यात्मक assays के लिए या आणविक अध्ययन के लिए इस्तेमाल किया जा सकता है, या तो सामान्य Foxp3 नियामकों के विषय में या इस तरह के butyrate या rapamycin के रूप में कुछ यौगिकों के लिए विशिष्ट प्रभाव का अध्ययन करने के लिए। Treg भेदभाव ड्राइविंग आणविक तंत्र के आगे समझने औतोइम्मुिनित या कैंसर में भविष्य चिकित्सकीय दृष्टिकोण विशेष Treg पीढ़ी और समारोह में शामिल अणुओं को लक्षित करने के लिए प्रासंगिक है।
वर्णित प्रोटोकॉल मानव सीडी 4 + Foxp3 + मानव भोले सीडी 4+ टी कोशिकाओं से iTregs के मजबूत प्रेरण सक्षम बनाता है। यह एक नए प्रोटोकॉल है कि हम हाल ही में वर्णित है, TGF-β, ATRA और rapamycin के संयोजन का उपयोग बेहतर इन विट्रो द…
The authors have nothing to disclose.
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
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GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
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130-094-131 | |||
Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |