פרוטוקול זה מתאר את דור phenotyping לשחזור של תאי T רגולטוריים מושרה אדם (iTregs) מתאי CD4 + T נאיביים במבחנה. פרוטוקולים שונים לזירוז FOXP3 לאפשר לחקר פנוטיפים iTreg הספציפיים שהושגו עם פרוטוקולי בהתאמה.
Regulatory T cells (Tregs) are an integral part of peripheral tolerance, suppressing immune reactions against self-structures and thus preventing autoimmune diseases. Clinical approaches to adoptively transfer Tregs, or to deplete Tregs in cancer, are underway with promising first outcomes.
Because the number of naturally occurring Tregs (nTregs) is very limited, studying certain Treg features using in vitro induced Tregs (iTregs) can be advantageous. To date, the best although not absolutely specific protein marker to delineate Tregs is the transcription factor FOXP3. Despite the importance of Tregs including non-redundant roles of peripherally induced Tregs, the protocols to generate iTregs are currently controversial, particularly for human cells. This protocol therefore describes the in vitro differentiation of human CD4+FOXP3+ iTregs from human naïve T cells using a range of Treg-inducing factors (TGF-β plus IL-2 only, or their combination with retinoic acid, rapamycin or butyrate) in parallel. It also describes the phenotyping of these cells by flow cytometry and qRT-PCR.
These protocols result in reproducible expression of FOXP3 and other Treg signature genes and enable the study of general FOXP3-regulatory mechanisms as well as protocol-specific effects to delineate the impact of certain factors. iTregs can be utilized to study various phenotypic aspects as well as molecular mechanisms of Treg induction. Detailed molecular studies are facilitated by relatively large cell numbers that can be obtained.
A limitation for the application of iTregs is the relative instability of FOXP3 expression in these cells compared to nTregs. iTregs generated by these protocols can also be used for functional assays such as studying their suppressive function, in which iTregs induced by TGF-β plus retinoic acid and rapamycin display superior suppressive activity. However, the suppressive capacity of iTregs can differ from nTregs and the use of appropriate controls is crucial.
CD4 + CD25 + FOXP3 + תאי T רגולטוריים (Tregs) לדכא תאי חיסון אחרים והם מתווכים קריטיים של סובלנות היקפית, אוטואימוניות במניעת 1 דלקת מופרזת. חשיבותה של Tregs מודגמת על ידי enteropathy האדם המחלה immunodysregulation polyendocrinopathy תסמונת ה- X-צמודות (אייפקס), שבו אובדן Tregs עקב מוטציות בשנות ה P3 תיבת forkhead גורם שעתוק Treg master' (FOXP3) מוביל למחלות אוטואימוניות מערכתי חמור, קטלן בגיל צעיר. עם זאת, Tregs לפעול כחרב פיפיות במערכת החיסונית: הם גם יכולים להפריע חסינות אנטי סרטנית במסגרות מסוימות 2. מניפולציה טיפולית של מספר ותפקוד Treg לפיכך כפופה חקירות קליניות רבות. בשנת סרטן, דלדול של Tregs יכול להיות רצוי והצלחה חלק גישות קליניות מעודדת מחקר נוסף 3. במחלות אוטואימוניות ודלקתיות, בנוסף השפעות טיפוליות של Tregs ב seveמודלי עכבר מחל RAL, ניסויים-האדם ראשונים האחרונים של העברת מאמצת Treg למנוע graft- מול מחל -host (GvHD) 4 – 7 ועל מנת להעריך את בטיחות בטיפול בסוכרת סוג 1 8 הראו תוצאות מבטיחות מאוד.
בטבע הופעת Tregs (nTregs) מהווה tTregs נגזרות הרתי ואת שולה מושרה pTregs, עם פונקציות חיוניות לא יתירים בשמירה על בריאות 9 – 11. עם זאת, מספרי nTreg מוגבלים, עידוד הגישה המשלימה של Tregs התרמה (iTregs) במבחנה מן מבשרי תא T נאיביים 12. עדיין יציבות iTregs, ככל הנראה בשל חוסר demethylation באזור demethylated שנקרא Treg הספציפי (TSDR) ב לוקוס גן FOXP3 13, נותרת חשש וכמה מחקרים מצביעים על כך in vivo מושרה Tregs יציבים יותר 14.
נכון להיום, FOXP3 נשאר מ 'החלבון הטוב ביותרarker עבור Tregs אבל זה לא ספציפי לחלוטין כי תאי CD4 + T CD25- קונבנציונאלי אדם זמני מבטאים רמות ביניים של FOXP3 באקטיבציה 15,16. למרות התקדמות משמעותית נעשתה הבהרת בקרת הביטוי FOXP3, הרבה נשאר להתגלות לגבי אינדוקציה, יציבות ותפקוד של FOXP3 במיוחד בתאים אנושיים. למרות ההבדלים כדי nTregs, במבחנה המושרה FOXP3 + CD4 + T תאים יכול לשמש כמערכת מודל ללמוד המנגנונים המולקולריים של אינדוקציה FOXP3 ו כנקודת המוצא לפיתוח פרוטוקולים בעתיד המאפשרים דור iTregs כי הם דומים יותר ב vivo שנוצר Tregs, אשר יכול להיות רלוונטי עבור אסטרטגיות העברת מאמצת בעתיד.
יש `אין פרוטוקול הזהב standard' לגרום iTregs אדם, ופרוטוקולים נוכחיים פותחו בהתבסס על מחק תנאי Treg וישכנע in vivo: אינטרלוקין 2 (IL-2) והאיתות גורם הגדילה הפיכת β (TGF-β) הם קריטיים לזירוז FOXP3 in vivo 17, וכל-טרנס החומצה הרטינואית (ATRA) – אשר מופק in vivo על ידי תאים דנדריטים הקשורים במעיים – משמש לעתים קרובות כדי לשפר אינדוקציה FOXP3 במבחנה 18 – 21. פתחנו פרוטוקולי Treg וישכנעו אדם נוספים באמצעות בוטיראט 22, בטן חיידקים נגזרת חומצת שומן קצרה שרשרת אשר הוצגה לאחרונה להגדיל בעכברי Treg אינדוקציה 23,24. אנחנו גם קימה לאחרונה פרוטוקול חדש עבור דור של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנה באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו Rapamycin 22, האחרון הוא יעד יונק אשר קליני של rapamycin (mTOR) מעכב כי ידוע כדי לקדם תחזוקת FOXP3 במהלך התרחבות אדם Treg 25,26.
שיטה זו מתארת את לשחזורדור במבחנה של CD4 אדם + FOXP3 + iTregs באמצעות סדרה של תנאים שונים, phenotyping הבא שלהם על ידי cytometry זרימת תגובת שרשרת פולימראז השעתוק כמוני הפוך (qRT-PCR) לחשוף את דפוסי פרוטוקול ספציפי ביטוי של FOXP3 ומולקולות חתימת Treg אחרים כגון כמו CD25, CTLA-4, EOS, כמו גם הדיכוי של-γ IFN ו- SATB1 הביטוי 22. אוכלוסיות התאים שנוצרו יכולות לשמש מבחנים תפקודיים לגבי פעילות מדכאת או עבור מחקרים מולקולריים, בין אם בנוגע רגולטורי FOXP3 כלליים או ללמוד השפעות ספציפיות תרכובות מסוימות כגון בוטיראט או rapamycin. הבנה נוספת של מנגנונים מולקולריים נהיגת בידול Treg רלוונטית ביותר עבור גישות טיפוליות עתידיות אוטואימוניות או סרטן למקד מולקולות מעורבות במיוחד בדור Treg ותפקוד.
הפרוטוקול המתואר מאפשר האינדוקציה החזקה של CD4 + אדם FOXP3 + iTregs מתאי אדם נאיביים CD4 + T. היא כוללת פרוטוקול חדשות שתארנו לאחרונה, באמצעות שילוב של TGF-β, ATRA ו rapamycin, לזירוז של iTregs עם פונקציה מדכאת מעולה במבחנת 22. לעומת פרוטוקולים שפורסמו אחרים, יתרון נוסף הוא ה?…
The authors have nothing to disclose.
Nina Nagel is gratefully acknowledged for technical assistance during the video shoot and experimental preparation. We thank Eva-Maria Weiss for help with the intracellular FOXP3 staining protocol and Elisabeth Suri-Payer and Nina Oberle for establishing the nTreg isolation protocol. Matilda Eriksson and Peri Noori are acknowledged for laboratory management.
Funding: A.S. was supported by a Marie Curie Intra European Fellowship within the 7th European Community Framework Programme, the Dr. Åke Olsson Foundation and KI research foundations; A.S. and J.T. were supported by a CERIC (Center of Excellence for Research on Inflammation and Cardiovascular disease) grant, J.T. was supported by Vetenskapsrådet Medicine and Health (Dnr 2011-3264), Torsten Söderberg Foundation, FP7 STATegra, AFA Insurance and Stockholm County Council.
All-trans retinoic acid | Sigma Aldrich | R2625-50MG | |||
anit-human Foxp3-APC clone 236A/E7 | eBioscience | 17-4777-42 | |||
anti-human CD25 microbeads | Miltenyi Biotec | 130-092-983 | |||
anti-human CD25-PE | Miltenyi Biotec | 130-091-024 | |||
anti-human CD28 antibody, LEAF Purified | Biolegend | 302914 | |||
anti-human CD3 Antibody, LEAF Purified | Biolegend | 317315 | |||
anti-human CD45RA , FITC | Miltenyi Biotec | 130-092-247 | |||
anti-human CD45RO PE clone UCHL1 | BD Biosciences | 555493 | |||
anti-human CD4-PerCP clone SK3; mIgG1 | BD Biosciences | 345770 | |||
anti-human CD8-eFluor 450 (clone OKT8), mIgG2a | eBioscience | 48-0086-42 | |||
anti-human CTLA-4 (CD152), clone BNI3, mIgG2ak, Brilliant violet 421 | BD Biosciences | 562743 | |||
anti-human IFN-g FITC clone 4S.B3; mIgG1k | eBioscience | 11-7319-81 | |||
Brefeldin A-containing solution: GolgiPlug | BD Biosciences | 555029 | |||
cDNA synthesis kit: SuperScript VILO(Reverse transcriptase) cDNA Synthesis Kit | Invitrogen | 11754-250 | |||
Density centrifugation medium: Ficoll-Paque | GE healthcare | 17-1440-03 | |||
DMSO 99,7% | Sigma Aldrich | D2650-5X5ML | |||
FBS, heat inactivated | Invitrogen | 10082-147 | |||
Fixable Viability Dye, eFluor 780 | eBioscience | 65-0865-14 or 65-0865-18 | |||
Foxp3 Staining Buffer Set | eBioscience | 00-5523-00 | Caution, contains Paraformaldehyde Can be also bought in combined kit with antibody; 77-5774-40 Anti-Human Foxp3 Staining Set APC Clone: 236A/E7 Set |
||
GlutaMAX (200 mM L-alanyl-L-glutamine) | Invitrogen | 35050-061 | |||
human naive CD4 T cell isolation kit II | Miltenyi Biotec | 130-094-131 | |||
![]()
|
![]()
|
130-094-131 | |||
Human serum albumin 50 g/l | Baxter | 1501057 | |||
Ionomycin from Streptomyces conglobatus >98% | Sigma Aldrich | I9657-1MG | |||
MACS LS-columns | Miltenyi Biotec | 130-042-401 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control APC Clone: P3.6.2.8.1 | eBioscience | 17-4714-42 | |||
mouse IgG1 K Isotype Control FITC 50 ug | eBioscience | 11-4714-81 | |||
mouse IgG2a isotype control, Brilliant violet 421, clone MOPC-173 | BD Biosciences | 563464 | |||
Pasteur pipet plastic, individually packed | Sarstedt | 86.1172.001 | |||
PMA PHORBOL 12-MYRISTATE 13-ACETATE | Sigma Aldrich | P1585-1MG | |||
Rapamycin | EMD (Merck) | 553210-100UG | |||
Recombinant Human IL-2, CF | R&D | 202-IL-050/CF | |||
Recombinant Human TGF-beta 1, CF | RnD | 240-B-010/CF | |||
RNA isolation kit: RNAqueous-Micro Kit | Ambion | AM1931 | |||
RPMI 1640 Medium | Invitrogen | 72400-054 | |||
Sodium butyrate | Sigma Aldrich | B5887-250MG | |||
T cell culture medium: X-Vivo 15 medium, with gentamicin+phenolred | Lonza | 04-418Q | |||
TaqMan Gene Expression Assay, FOXP3 (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4331182; assay ID: Hs01085834_m1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Assay, RPL13A (Best Coverage) | Applied Biosystems | 4351370; assay ID: Hs04194366_g1 | Caution, contains Paraformaldehyde | ||
TaqMan Gene Expression Master mix | Applied Biosystems | 4369514 |