केशिका फीडर परख में खाद्य सेवन के उपाय<em> ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर</em
Summary
The CApillary FEeder (CAFE) assay is a simple, budget-friendly, highly reliable method for investigating mechanisms underlying food intake. Used with the highly versatile genetic model organism Drosophila melanogaster, it provides a powerful means of gaining new insights into regulatory mechanisms of food intake.
Abstract
For most animals, feeding is an essential behavior for securing survival, and it influences development, locomotion, health and reproduction. Ingestion of the right type and quantity of food therefore has a major influence on quality of life. Research on feeding behavior focuses on the underlying processes that ensure actual feeding and unravels the role of factors regulating internal energy homeostasis and the neuronal bases of decision-making. The model organism Drosophila melanogaster, with its great variety of genetically traceable tools for labeling and manipulating single neurons, allows mapping of neuronal networks and identification of molecular signaling cascades involved in the regulation of food intake. This report demonstrates the CApillary FEeder assay (CAFE) and shows how to measure food intake in a group of flies for time spans ranging from hours to days. This easy-to-use assay consists of glass capillaries filled with liquid food that flies can freely access and feed on. Food consumption in the assay is accurately determined using simple measurement tools. Herein we describe step-by-step the method from setup to successful execution of the CAFE assay, and provide practical examples to analyze the food intake of a group of flies under controlled conditions. The reader is guided through possible limitations of the assay, and advantages and disadvantages of the method compared to other feeding assays in D. melanogaster are evaluated.
Introduction
भोजन आवश्यक है, हालांकि, इस तरह के भोजन का सेवन bulimia, आहार या सामान्य प्रवृत्ति लगाता पेट भर खा करने के रूप में विकारों खाने में जिसके परिणामस्वरूप की ढील व्यक्तियों और समाज 1, 2, 3 पर खर्च होती है। वर्तमान शोध के लक्ष्य के भोजन का सेवन की नियामक तंत्र को उजागर करने और अव्यवस्था का गठन circumventing के लिए एक रणनीति प्रदान करना है। स्तनधारी जीवों मॉडल का उपयोग कर कई अध्ययनों से विकारों 4, 5, 6 खाने में circuitry और संकेत प्रणाली की भूमिका की नए अंतर्दृष्टि प्रदान की है। फिर भी, इन विकारों अंतर्निहित neuronal और आणविक अड्डों में से हमारे ज्ञान से पूरा दूर रहता है। हाल के वर्षों में, फल मक्खी ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर metabolis के नियमन में बुनियादी यंत्रवत अंतर्दृष्टि को उजागर करने के लिए एक मूल्यवान मॉडल प्रणाली बन गया हैएम 7, 8, 9। ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर के लिए केशिका फीडर (कैफे) परख 2007 में सेमूर Benzer की प्रयोगशाला मक्खी 10, 11 में Dethier से पहले के काम से प्रेरित में स्थापित किया गया था। कैफे परख के लिए यह संभव सीधे ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में भोजन का सेवन को मापने के लिए बनाया है। इस व्यवहार परीक्षण प्रणाली में, मक्खियों वर्गीकृत गिलास एक शीशी के अंदर रखा केशिकाओं में प्रदान तरल भोजन को खाते हैं। केशिका meniscus की गिरावट के वाष्पीकरण और भोजन की खपत के माध्यम से खाद्य समाधान के नुकसान का संकेत है। मक्खियों के बिना शीशियों से वाष्पीकरण की दर का निर्धारण भोजन का सेवन की सही मात्रा का ठहराव की अनुमति देता है।
कैफे परख कई व्यवहार ड्रोसोफिला मेलानोगास्टर में खिला मापने के लिए इस्तेमाल मानदंड में से एक है और शोधकर्ताओं ने अपने विशिष्ट के लिए सबसे उपयुक्त एक को चुनना होगाप्रश्न। एक निश्चित परख का उपयोग करने के लिए निम्नलिखित बातों पर विचार करना चाहिए: निर्णय प्रदान की भोजन की प्रकृति; खिला हालत; सेवन या पोषक तत्वों की तेज और जांच के भोजन की खपत या भोजन के लिए प्रतिक्रिया की माप।
कैफे परख इस रिपोर्ट में वर्णित के रूप में एक ईमानदार खिला शर्त के तहत एक तरल खाद्य स्रोत के भोजन का सेवन के बाद के लिए आदर्श है। वैकल्पिक रूप से भोजन का सेवन एक शीशी में या एक प्लेट पर एक रंग खाद्य स्रोत पर एक मक्खी समूह के लिए मापा जा सकता है। मक्खियों सामान्य रूप से मारे गए हैं या anesthetized खिलाने के बाद और किया जाता डाई की राशि स्पेक्ट्रोमेट्री या दाग पेट के दृश्य निरीक्षण से निर्धारित होता है। मक्खियों सेवन के बाद केवल 30 मिनट भोजन किया जाता उगलना शुरू करते हैं, इसलिए इस दृष्टिकोण निरंतर लंबे समय तक खिलाने के विश्लेषण के लिए उपयोग करने के लिए मुश्किल है 12 व्यवहार, 13।
इसके विपरीत जब मक्खियों absorbable डाई बरकरार रखा जाता हैरेडियोधर्मी ट्रेसर के साथ इस्तेमाल कर रहे हैं और रेडियो आइसोटोप के अपने खपत एक जगमगाहट काउंटर 14, 15 में रन बनाए है। मक्खी पाचन तंत्र द्वारा radiolabel के अवशोषण लंबे समय तक भोजन तेज माप संभव बनाता है, बल्कि इसलिए कि गैर अवशोषित और उत्सर्जित दरियाफ्त अणुओं की खपत के मूल्यवान समझना के लिए नेतृत्व कर सकता है। एक और दृष्टिकोण ड्रोसोफिला में भोजन करने के लिए प्रतिक्रिया को मापने के लिए मेलानोगास्टर सूंड विस्तार प्रतिक्रिया (प्रति) है, जो सामान्य रूप से भोजन का सेवन 16 के लिए होता है। इस सुरुचिपूर्ण विधि एक खाद्य प्रोत्साहन के लिए प्रारंभिक प्रतिक्रिया उपायों लेकिन सेवन की मात्रा रिकॉर्ड नहीं है। भोजन का सेवन गतिशील कई के बाद पाचन प्रतिक्रिया का संकेत है कि खिला 17, 18 के नियमन के लिए महत्वपूर्ण हैं का उपयोग कर खिलाने के दौरान निकाला जाता है। कई प्रयासों के प्रति परख में अर्द्ध स्वचालित डेटा संग्रह करने के लिए हाल के वर्षों में किया गया है <sअप वर्ग = "xref"> 19, 20। प्रति एक बिजली पैड या इलेक्ट्रोड के संयोजन के द्वारा पता चला है और कंप्यूटर के माध्यम से गिना जाता है। रेडियो आइसोटोप तेज के साथ प्रति परख का मेल से पता चला है कि इस परख मात्रा खिला मतभेद 18 का पता लगाने के लिए कम संवेदनशीलता द्वारा सीमित है। मैनुअल खिला परख (mafe) 21 है, जिसमें एक मक्खी एक गिलास केशिका के साथ मैन्युअल खिलाया जाता है, हाल ही में एक भी स्थिर मक्खी में भोजन तेज मापने के लिए विकसित किया गया था। Mafe परख foraging और दीक्षा खिलाने का हस्तक्षेप समाप्त और सेकंड के एक समय संकल्प, और प्रति की दीक्षा है और भोजन की खपत परख में स्वतंत्र रूप से नजर रखी जा सकती है। हालांकि, जिस तरह मक्खी की स्थिरीकरण खिला व्यवहार के कुछ पहलुओं को प्रभावित करता है (जैसे हरकत, प्रेरणा) अभी भी जांच की जानी चाहिए। विभिन्न परीक्षणों की उत्कृष्ट तुलनात्मक समीक्षा ड्रोसोफिला मुझ में भोजन की खपत को मापने के लिए के लिएlanogaster और सबसे उपयुक्त एक खोज शोधकर्ताओं मदद करने के लिए, देशपांडे और मार्क्स द्वारा रिपोर्ट देखें 13, 22।
कैफे परख ऊपर वर्णित अन्य assays के नुकसान की कुछ बचा जाता है और भोजन का सेवन के विश्वसनीय माप के साथ उपयोग की सादगी को जोड़ती है। इधर, कैफे परख के एक विस्तृत वर्णन प्रदान की जाती है और हम एक साधारण सेटअप संशोधन दिखाने के वाष्पीकरण को कम करने के लिए। एक दो खाना पसंद परख (छोटी और लंबी अवधि) और मक्खियों की सुक्रोज तेज सहित प्रतिनिधि परिणाम प्रदर्शन किया है। चर्चा में हम वैकल्पिक तरीकों कैफे परख करते हैं, और संभावित सीमाओं को उजागर करने के साथ हमारे वर्णित विधि की तुलना करें।
Protocol
Representative Results
Discussion
रिपोर्ट में एक कदम-दर-कदम फैशन कैफे में परख का वर्णन करता है, तकनीकी सेटअप और प्रयोगशाला में इसके सफल प्रदर्शन पर ध्यान दे। अपनी सादगी के कारण, इस परख भी एक स्कूल प्रयोग के रूप में शैक्षिक रूप से इस्तेमा?…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
We thank the past and present members of the Scholz lab for discussion and Helga Döring for excellent technical support. We especially thank the members of the Biocenter workshop of the University of Cologne for their support and creativity. The work is supported by SFB 1340, SysMedAlc, and DAAD-Siemens.
Materials
| Vials (breeding) | Greiner Bio-One | 960177 | www.greinerbioone.com |
| Vials (CAFE assay) | Greiner Bio-One | 217101 | www.greinerbioone.com |
| Lid-CAFE assay | Workshop | – | – |
| Plastic box, low wall | Plastime | 353 | www.plastime.it |
| Cover for the plastic box | Workshop | – | – |
| Capillaries | BLAUBRAND | REF 7087 07 | www.brand.de |
| Pipette tips | Greiner Bio-One | 771290 | www.greinerbioone.com |
| Filter paper circles | Whatman | 10 311 804 | www.sigmaaldrich.com |
| D(+)-Sucrose | AppliChem | 57-50-1 | www.applichem.com |
| Ethanol absolute | VWR Chemicals | 20,821,330 | www.vwr.com |
| Food color (red, E124) | Backfun | 10027 | www.backfun.de |
| Food color (blue, E133) | Backfun | 10030 | www.backfun.de |
| Soap solution (CVK 8) | CVH | 103220 | www.cvh.de |
| Digital caliper | GARANT | 412,616 | www.hoffmann-group.com |
| Vials (breeding) | Height 9.8 cm, diameter 4.8 cm | ||
| Vials (CAFE assay) | Height 8 cm, diameter 3.3 cm | ||
| Lid-CAFE assay | Produced in university workshop, technical drawing supplied | ||
| Plastic box, low wall | A plastic grid inlay was custom-made for 8 x 10 vial positions | ||
| Cover for the plastic box | Dimensions (37 x29 x18 cm) | ||
| Capillaries | DIN ISO 7550 norm, IVD-guideline 98/79 EG, ends polished | ||
| Pipette tips | Pipettes for the outer circle are cut according to the lid | ||
| Filter paper circles | 45 mm diameter works nicely if folded for the vials used | ||
| D(+)-Sucrose | Not harmful | ||
| Ethanol absolute | Highly flammable liquid and vapor | ||
| Food color (red, E124) | Not stated | ||
| Food color (blue, E133) | Not stated | ||
| Soap solution (CVK 8) | Odor neutral soap | ||
| Digital caliper | |||
| Standard fly food | (for 20 L) | ||
| Agar | 160 g | ||
| Brewer`s Yeast | 299.33 g | ||
| Cornmeal | 1200g | ||
| Molasses | 1.6 L | ||
| Propionic acid | 57.3 mL | ||
| Nipagin 30% | 160 mL |
References
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