Dissection et observation de Honey Bee Dorsale Navire d'études de la fonction cardiaque

Summary

The abdominal dorsal vessel of the honey bee and other insects serves as the functional equivalent of the mammalian heart and plays an important role in nutrient transport, waste removal, immune function, and more. Here we describe a protocol for the visualization and pharmacological manipulation of bee heart rate.

Abstract

The European honey bee, Apis mellifera L., is a valuable agricultural and commercial resource noted for producing honey and providing crop pollination services, as well as an important model social insect used to study memory and learning, aging, and more. Here we describe a detailed protocol for the dissection of the dorsal abdominal wall of a bee in order to visualize its dorsal vessel, which serves the role of the heart in the insect. A successful dissection will expose a functional heart that, under the proper conditions, can maintain a steady heartbeat for an extended period of time. This allows the investigator to manipulate heart rate through the application of cardiomodulatory compounds to the dorsal vessel. By using either a digital microscope or a microscope equipped with a digital camera, the investigator can make video recordings of the dorsal vessel before and after treatment with test compounds. The videos can then be scored at a time convenient to the user in order to determine changes in heart rate, as well as changes in the pattern of heartbeats, following treatment. The advantages of this protocol are that it is relatively inexpensive to set up, easy to learn, requires little space or equipment, and takes very little time to conduct.

Introduction

L'objectif global de cette méthode est de permettre à l'enquêteur d'observer et de quantifier l'effet qu'un agent pharmacologique a sur le taux d'abeilles cardiaque rapidement et facilement. Les abeilles, comme d'autres insectes, ont un système circulatoire ouvert qui dissémine hémolymphe, l'équivalent d'insectes de sang, à travers la cavité du corps, connu sous le nom hémocèle. La circulation de l' hémolymphe est essentiel pour le transport des nutriments, les facteurs immunitaires, des déchets, ainsi neurohormones et d' autres molécules de signalisation ^1. La circulation est facilitée par le vaisseau dorsal, qui se prolonge le long de la ligne médiane dorsale de l'insecte, ainsi que les organes pulsatiles accessoires. Le vaisseau dorsal est divisé en deux sections fonctionnellement distinctes, désigné le cœur dans l'abdomen et l'aorte dans le thorax et la tête. contractions propagés dans l'hémolymphe de la pompe cardiaque vers le thorax et la tête, tandis que les organes pulsatiles accessoires assurent l'écoulement de l'hémolymphe aux extrémités.

<pclass = "jove_content"> fonction Insect cardiaque peut être observée en utilisant une variété de méthodes, en fonction de la taille, le stade de la physiologie ou de la vie de l'insecte. Une approche commune pour l' observation de la fréquence cardiaque chez les larves ou petits insectes est l'utilisation de l' imagerie intravitale ^2. Cette méthode est moins utile pour les abeilles adultes, cependant, car il peut être difficile de voir clairement le vaisseau dorsal à travers la paroi abdominale. Une approche établie pour enregistrer le rythme cardiaque dans une variété d'insectes, y compris les abeilles, est l'utilisation de contacts thermographie, qui utilise des thermistances appliqués à l'extérieur de l'insecte pour détecter les pulsations cardiaques ^3,4. La fréquence cardiaque chez les abeilles adultes a également été enregistrée en utilisant une technique électrophysiologique pour mesurer un signal d'impédance électrique ^4,5. Cette technique nécessite l'insertion d'électrodes dans l'animal à côté du coeur et l'utilisation d'un convertisseur d'impédance pour enregistrer les battements de coeur ^4. De même, des électrocardiogrammes ont été utilisés pour DeTect signaux électriques produits par le coeur et combiné avec l' enregistrement vidéo de l'abeille pour observer les changements dans l' activité cardiaque ^6. Un net avantage à ces approches est que la fréquence cardiaque est évaluée, une abeille vivante intacte, plutôt que dans un échantillon disséqué, ce qui contribue à assurer la disponibilité de la gamme complète des réponses physiologiques à ce sujet. Les défis de ces approches comprennent la comptabilité pour l'immobilisation ou anesthetization du sujet, la nécessité de limiter les variables et les stimuli extérieurs qui pourraient altérer la fréquence cardiaque, ainsi que la détermination d'une méthode de livraison appropriée lors de l'essai des agents pharmacologiques.

Une autre approche qui a été utilisée pour étudier l' activité cardiaque d'abeille est de disséquer partiellement l'insecte afin d'exposer le cœur, puis mesurer les contractions des vaisseaux dorsales en utilisant un déplacement transducteur de force ^7. Dans ce protocole, le cœur est constamment baigné avec du sérum physiologique en cours d'exécution et co testmpounds peuvent être dissous dans cette solution pour l' application à l'objet ^7. Une différence significative entre cette méthode et ceux décrits précédemment est que le cordon nerveux ventral est éliminé, ce qui élimine le rôle que le système nerveux central a été montré à jouer dans la modulation de fréquence cardiaque ^5. Le résultat est que le rythme cardiaque de référence, ce qui est généralement très irrégulier, se stabilise à une fréquence beaucoup plus faible que l' amplitude et est typiquement observée chez un insecte vivant ^5,7. Ce que toutes ces méthodes ont en commun est qu'elles nécessitent un équipement hautement spécialisé et souvent coûteux, en plus d'un certain niveau d'expertise, afin d'être menée. Peut-être le plus grand inconvénient est que aucune de ces approches sont particulièrement bien adaptés à des expériences qui impliquent de test d'un grand nombre de sujets, tels que le criblage d'une banque de composés potentiellement cardiomodulatory.

La plus grande force de l'approche décrite iciest sa simplicité. Le protocole est relativement facile à maîtriser, l'installation nécessite peu d'espace, et seule une contribution financière minimale est nécessaire. La méthode nécessite peu plus que quelques abeilles, quelques instruments chirurgicaux, une solution isotonique, et soit un microscope numérique ou un microscope traditionnel avec un appareil photo numérique. Les abeilles sont disséqués pour visualiser le vaisseau dorsal et des vidéos numériques sont utilisés pour enregistrer le rythme cardiaque avant et après traitement avec des agents pharmacologiques. Bien que l' enregistrement vidéo est pas réellement nécessaire d'observer les changements de la fréquence cardiaque, il va grandement augmenter le débit (ie, le nombre de sujets qui peuvent être traités dans un laps de temps donné). L'enquêteur peut maximiser l'efficacité en enregistrant un grand nombre de vidéos à la fois, puis plus tard en marquant ces vidéos à un moment plus opportun. Un autre avantage de cette approche est que les vidéos permettent à l'enquêteur de recommencer, si le processus de notation est interrompu, et la rendre plus facile pour le vViewer aveugler au traitement afin de réduire le biais.

Protocol

1. Collecte et préparation des sujets d'essai Recueillir le nombre approprié d'abeilles de la colonie. REMARQUE: Le nombre nécessaire dépend non seulement de la taille et la portée de l'expérience, mais aussi la compétence de l'enquêteur. Par exemple, s'il y a 2 groupes de traitement avec une taille d'échantillon souhaitée de 10 abeilles par groupe, un enquêteur raisonnablement qualifiée pourrait recueillir au moins 30 abeilles pour tenir compte des dissections infru…

Representative Results

Comme bon nombre des composés pharmacologiquement actifs qui pourraient être testés en utilisant ce protocole ne sont pas solubles dans l'eau, il est nécessaire d'avoir un solvant fiable qui permettra des composés d'essai à être livrés via la solution isotonique utilisée pour baigner le vaisseau dorsal. Le diméthylsulfoxyde (DMSO) est un solvant qui est couramment utilisée comme véhicule pour délivrer des médicaments et d' autres composés expérimentaux sur…

Discussion

The protocol presented here provides a simple and effective approach to testing pharmacological compounds for their effects on honey bee heart rate. As observed in prior experiments that either transect the ventral nerve cord of a living insect⁵ or dissect out the ventral nerve cord when exposing the dorsal vessel⁷, the loss of central nervous system regulation results in a stable, low frequency heartbeat. The low frequency of beats allows the investigator to visually assess heart rate without havin…

Materials

Dino-Lite Edge digital USB microscope	Dino-Lite	AM4815ZT	Any digital microscope or similar setup will suffice
Microscope stand	Dino-Lite	RK-10	Any stand appropriate for the digital microscope
Laptop or PC			Necessary for digital microscope
Microdissection scissors (Vannas, 8cm, Straight, 5mm Blades)	World Precision Instruments	14003	Any similar scissors suitable for microdissection will suffice
Microdissecting Forceps, 10.2cm, Angled (2 pair)	World Precision Instruments	504482	Any similar forceps suitable for microdissection will suffice
Ringers solution 1/4 strength tablets	Sigma-Aldrich	96724-100TAB
Dissecting tray			Any surface suitable for microdissection
Single channel 10 µl pipette			Any device capable of accurately delivering 10 µl volume
Pipette tips
Small beaker or container of water			Used to rinse instruments between subjects
Hand tally counter	Office Depot	295033	Any similar product will suffice
Timer	Office Depot	644219	Any similar product will suffice
Deionized water			Preparation of Ringers solution and rinsing instruments