Skanning elektronmikroskopi (SEM) Protokoller for Problema Plant, eggsporesopper, og Fungal Samples

Summary

Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.

Abstract

Vanlige problemer i behandling av biologiske prøver for observasjoner med scanning elektronmikroskop (SEM) innbefatter at celler faller sammen, behandling av prøver fra våte microenvironments og celle-ødeleggelse. Ved hjelp av små blomster vev, eggsporesopper cyster, og sopp sporer (Agaricales) som eksempler, spesifikke protokoller for å behandle ømfintlige prøvene er beskrevet her at overvinne noen av de viktigste utfordringene i prøvebehandling for bildeopptak under SEM.

Blomster meristemer fast med FAA (Formalin-Acetic-alkohol) og behandlet med Critical Point Dryer (CPD) ble ikke vist kollapset mobile vegger eller forvrengt organer. Disse resultatene er avgjørende for gjenoppbyggingen av floral utvikling. En lignende CPD-basert behandling av prøver fra våte mikromiljøer, slik som glutaraldehyd-fiks eggsporesopper cyster, er optimal for å teste den differensielle vekst av diagnostiske egenskaper (f.eks, cysten pigger) på forskjellige typer substrates. Ødeleggelse av sykepleier celler knyttet til sopp sporer ble unngått etter utvanning, dehydrering, og CPD behandling, et viktig skritt for videre funksjonelle studier av disse cellene.

Protokollene beskrevet her representerer lav pris og raske alternativer for erverv av bilder av god kvalitet for å rekonstruere vekstprosesser og for å studere diagnostiske egenskaper.

Introduction

I biologi, har bruken av scanning elektronmikroskopi (SEM) er utvidet til studier av strukturell utvikling, sammenlignende morfologi, organutvikling, og karakterisering av populasjoner eller arter ^1. Med sin to-dimensjonal visning av mikroskopiske strukturer, områder som micromorphology og systematikk profit SEM teknikk fremskritt siden andre halvdel av det ^20. århundre. For eksempel, innføring av frese belegget metodikken i 1970 gjort mulig observasjoner av ømfintlige materialer som skyter toppunktene og blomster som forsterker avbildning av ikke-ledende vev ^{2, 3.} SEM bruker elektroner kastet ut fra overflaten av prøven for å reprodusere topografien i en høy-vakuum miljø ^4.

Studier med SEM er fokusert både i slutning av strukturelle tegn og gjenoppbygging av growth prosesser. Nye strukturelle tegn som er relevante for taksonomi og systematikk til et bredt spekter av organismer har blitt oppdaget fra SEM observasjoner. For eksempel plantetrekk brukes for arter diagnose eller supraspecific klassifikasjoner, for eksempel vestured groper av tre ^_5, stigma mangfold ^6, nectary og floral morfologi ^{7, 8,} trichome detaljer ⁹ og pollenkorn ^{10, 11,} kan ikke være riktig visualiseres uten SEM. Vellykket observasjoner med konvensjonelle SEM har også oppnådd for lang tid formalinfikserte organismer ¹² og plante herbarium eksemplarer ^13.

På den annen side, studier av rekonstruksjon av vekstprosesser ved hjelp av SEM involverer et bredt spekter av emner, for eksempel organutvikling ^14, infections forårsaket av bakterier ^15, plante rot fysiologi ^16, parasitt-vert festemekanismer ^{17, 18,} narkotika effekter på parasitter ^19, mycoparasitism og antibiosis ^{20, 21,} vekst misdannelses ^22, komparativ utvikling av ville og mutante personer ^23, og hele livssykluser ^24. Selv om miljø scanning elektronmikroskop (ESEM) ²⁵ kan ha viktige fordeler for observasjon av våte biologiske prøver på vekstprosesser, kan sart materiale fremdeles bli svekket, selv i lav-vakuum-tilstand ESEM), og må behandles tilfredsstillende for å unngå tap av verdifulle morfologiske observasjon.

I denne utredningen, en gjennomgang av spesifikke protokoller for SEM observasjon av tre different typer prøver blir presentert: floral meristemer, Oomycetes (Saprolegnia), og soppmateriale. Disse protokollene kompilere opplevelsen av våre tidligere SEM-baserte studier ^{26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33,} hvor spesifikke vansker og alternative løsninger har blitt funnet. I tilfelle av anlegget komparativ utviklingsmessige og strukturelle studier, bruk av SEM startet i 1970 ^{34, 35,} og siden da, oppdaget forskerne at visse floral funksjoner er mer labile enn tidligere antatt ^36. Rekonstruksjon av floral utvikling innebærer fangst av alle stadier mellom unge blomster meristemer og anthesis. For å nå dette målet, er det essential at prøven topografi og celleveggen integritet ikke blir kompromittert etter fiksering og påfølgende dehydrering. Unge floral meristemer er spesielt utsatt for celleveggen kollaps (Tall 1a, 1b). Tilsvarende delikate strukturer som nectaries, petals, arr og sporangia krever effektive og undamaging protokoller. Denne anmeldelsen oppsummerer en optimal protokoll for å holde små og delikate vev intakt for SEM bildebehandling.

Når det gjelder de Oomycetes (Stramenopiles) -en av de mest varierte og utbredte grupper av parasitter, med verter som strekker seg fra mikrober og planter til virvelløse dyr og virveldyr ³⁷ – det er sporer som vokser og utvikler seg i et vått miljø. Denne tilstanden er en utfordring for SEM observasjon fordi sporene trenger en tilstrekkelig underlag ikke egnet for standard SEM protokoller. Blant de Oomycetes, arter av Saprolegnia er av spesiell interesse fordi de can forårsake alvorlige reduksjoner i akvakulturer, fiskeri og amfibier populasjoner ^38. Micromorphological egenskaper, for eksempel de krok pigger cyster, er blitt funnet å være nyttig for å identifisere arter av Saprolegnia, som er grunnleggende for å etablere infeksjon kontroller og potensielle behandlinger ^39. Her er det en forsøksprotokoll for å sammenligne mønstre av ryggraden vekst av cyster på forskjellige substrater, og å manipulere prøve for kritiske punktet tørker (CPD) fremstilling og etterfølgende SEM observasjon.

I et tredje tilfelle, er det interessante funn som kom opp etter en inspeksjon av sporer av sopp Phellorinia herculanea f. lata f. nova (Agaricales) ^31. Sammen med sporene, ble en gruppe av uventede barnehage celler identifisert under SEM. Med tidligere tradisjonelle protokoller og ubehandlet materiale, kom sykepleier celler out fullstendig kollapset (Figur 1c). Ytterligere slutninger om spesielle vev knyttet til sporene kan gjøres med enkle, men viktige endringer i standard tilnærminger beskrevet her (figur 1D).

I denne gjennomgangen, er det detaljerte SEM protokoller som kan brukes til å håndtere forskjellige problemer i forbindelse med SEM observasjon i angiosperms, Oomycetes, og Agaricales, slik som at celler faller sammen og krymping meristematic vev, ikke-optimal vekst av cyste pigger, og ødeleggelse av flyktige vev, henholdsvis.

Figur 1: Sammenligning av prøvene som er behandlet uten (a, c) og med (b, d) protokollen FAA-etanol-CPD. (A – b) Blomster knopper av Anacyclus clavatus, mid-utvikling. Bud behandles med osmiumtetroksid ^{46 <}/ sup> (a) og Bud behandles med FAA-CPD-protokollen (b). (C – d) Sykepleier celler med sporer av Phellorinia herculanea f. lata. Tørkede prøver uten noen behandling (c) og med den protokoll som er beskrevet her for Agaricales (d). Sporer i oransje. Scales: (ab) 100 mikrometer, (cd) 50 mikrometer. Bilder ble tatt av Y. Ruiz-León. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.

Protocol

MERK: Denne protokollen omfatter seks hoveddeler, tre viet til bestemte organismer (§§ 1-3), og tre som beskriver prosedyrer som er felles for alle (4-6). Stjerne (*) indikerer trinn modifisert av forskere. 1. Studier av Utvikling og fullt dannet anleggsstruktur Innsamling og fiksering Dersom plantematerialet samles på et sted uten tilgang til et avtrekksskap, og innføre dyppe materialet i 70% etanol i sentrifugerør. Ideelt dyppe materialet etter 48 …

Representative Results

Blomster Utvikling og Fiksering av Utvikling og fullt dannet anleggsstruktur Bruke FAA-CPD-protokollen er beskrevet her, er unge og modne plantevev optimalt fast og dehydrert for SEM bildebehandling. Prosesser som blomsterutvikling kan rekonstrueres fordi topografi og formen av knopper ikke blir forvrengt av celle krymping (fig 1b, 1d, 4a-f). Strukturer med komplekse former kan med hell belagt med et jevnt lag a…

Discussion

Med hensyn til standard SEM protokoller, prosedyrer som presenteres her inkluderer relativt rask, lett å følge, og rimelige metoder. Avhengig av hvor mye prøver og på enkel behandling, tar det fire til fem dager for å hente bilder av god kvalitet. Inkludert tilstrekkelige sikkerhetsregler for CPD og SEM drift, prosedyrene er lett å håndtere. Spesiell forsiktighet bør tas med formalin og glutaraldehyd (se trinn 1.1.1 til 1.1.3 og 2.1.5 i protokollen). Det er visse skritt der, hvis det er nødvendig, kan prosessen…

Materials

Acetic acid	No specific supplier		Skin irritation, eye irritation
aluminium stubs	Ted Pella, Inc.	16221	www.tedpella.com
Centrifuge tubes	No specific supplier
Critical Point Dryer	Polaron Quatum Technologies	CPD7501
D (+) Glucose	Merck	1,083,421,000
Double sided sellotape	No specific supplier
Ethanol absolute	No specific supplier.		Flammable
European bacteriological agar	Conda	1800.00	www.condalab.com
Filter paper	No specific supplier
Forceps	No specific supplier
Formalin 4%	No specific supplier.		Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable
Glass cover slips	No specific supplier
Glass hermetic container	No specific supplier
Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611  (L)	Dismadel S.L.	3336	www.dismadel.com
Mycological peptone	Conda	1922.00	www.condalab.com
needles	No specific supplier
Petri dishes	No specific supplier
Plastic containers	No specific supplier
Sample holder with lid  for the critical point dryer	Ted Pella, Inc.	4591	www.tedpella.com
scalpels	No specific supplier
Scanning Electron Microscope	Hitachi	S3000N
Software for SEM
Solution A: NaH2PO4
Solution B: Na2HPO4
Specimen holders	No specific supplier
Sputter coater	Balzers	SCD 004
Stereomicroscope	No specific supplier
Transmission Electron Microscope (TEM) grids	Electron Microscopy Sciences	G200 (Square Mesh)	www.emsdiassum.com
Tweezers	No specific supplier