Microscopia Eletrônica de Varredura (MEV) Protocolos para a Problemática da planta, oomiceto e amostras fúngicas
Summary
Problems in the processing of biological samples for scanning electron microscopy observation include cell collapse, treatment of samples from wet microenvironments and cell destruction. Low-cost and relatively rapid protocols suited for preparing challenging samples such as floral meristems, oomycete cysts, and fungi (Agaricales) are compiled and detailed here.
Abstract
Os problemas mais comuns no processamento de amostras biológicas para observações ao microscópio eletrônico de varredura (MEV) incluem colapso das células, o tratamento de amostras de microambientes molhadas e destruição celular. Utilizando tecidos jovens florais, cistos oomicetos e esporos de fungos (Agaricales) como exemplos, protocolos específicos para processar amostras delicadas são descritos aqui que superar alguns dos principais desafios no tratamento da amostra para a captura de imagem sob o SEM.
meristemas florais fixos com FAA (formalina-acético-Álcool) e processados com o Ponto Crítico Secador (CPD) não apresentaram colapso paredes celulares ou órgãos distorcidas. Estes resultados são cruciais para a reconstrução do desenvolvimento floral. Um tratamento à base de CPD semelhante de amostras de micro-ambientes molhados, tais como os cistos oomicetos fixadas com glutaraldeído, é ideal para testar o crescimento diferencial de características de diagnóstico (por exemplo, os espinhos de quisto) em diferentes tipos de substrates. A destruição das células ligadas a enfermeira esporos de fungos foi evitada após re-hidratação, desidratação, e o tratamento de CPD, um passo importante para mais estudos funcionais destas células.
Os protocolos detalhados aqui representam de baixo custo e alternativas rápidas para a aquisição de imagens de boa qualidade para reconstruir os processos de crescimento e estudar características de diagnóstico.
Introduction
Na biologia, o uso de microscopia eletrônica de varredura (SEM) foi estendido para estudos de evolução estrutural, a morfologia comparativa, o desenvolvimento de órgãos, e caracterização de populações ou espécies 1. Com a sua visão bidimensional de estruturas microscópicas, áreas como a micromorfologia e sistemática lucrado com SEM técnica avanços desde a segunda metade do século 20. Por exemplo, a introdução da metodologia de revestimento por pulverização na década de 1970 fez eventuais observações de materiais delicados, como ápices vegetativos e flores que reforcem a imagem de tecidos não condutores 2, 3. SEM utiliza electrões ejectados a partir da superfície do espécime de reproduzir a topografia num ambiente de alto vácuo 4.
Estudos envolvendo SEM estão focados tanto a inferência de caracteres estruturais ea reconstrução da growth processos. Novos personagens estruturais relevantes para a taxonomia e sistemática de uma vasta gama de organismos foram descobertos a partir de observações SEM. Por exemplo, características de plantas utilizado para o diagnóstico espécie ou classificações supraspecific, como os poços guarnecidas de madeira 5, o estigma diversidade 6, nectary e floral morfologia 7, 8, detalhes de tricomas 9, e grãos de pólen 10, 11, pode não ser corretamente visualizadas sem SEM. Observações de sucesso com SEM convencional também foram atingidos por longa data organismos fixados em formol 12 e herbário espécimes de plantas 13.
Por outro lado, os estudos de reconstrução dos processos de crescimento utilizando SEM envolve uma ampla gama de tópicos, tais como o desenvolvimento de órgãos 14, INFECÇÕES induzidas por bactérias 15, planta raiz fisiologia 16, os mecanismos de fixação parasita-hospedeiro 17, 18, efeitos de drogas sobre parasitas 19, micoparasitismo e antibiose 20, 21, o crescimento malformação 22, de desenvolvimento comparativa de indivíduos selvagens e mutantes 23, e ciclos de vida inteiras 24. Embora microscópios electrónicos de varrimento ambiental (ESEM) 25 pode ter vantagens importantes para a observação de amostras biológicas molhado em processos de crescimento, material delicado ainda pode ser comprometida mesmo na condição de baixo vácuo do ESEM), e têm de ser processados de forma adequada para evitar a perda observação morfológica de valioso.
Neste artigo, uma revisão de protocolos específicos para a observação SEM de três different tipos de amostras é apresentada: meristemas florais, oomicetos (Saprolegnia), e material fúngico. Estes protocolos compilar a experiência de nossos estudos anteriores baseados em SEM 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, onde as dificuldades específicas e soluções alternativas foram encontrados. No caso de uma instalação de desenvolvimento comparativa e estudos estruturais, a utilização de SEM começou na década de 1970 34, 35, e desde então, os pesquisadores descobriram que certas características florais são mais instáveis do que se pensava 36. Reconstrução do desenvolvimento floral envolve a captura de todas as fases entre jovens meristemas florais e antese. Para alcançar este objectivo, é ESSEntial que a topografia da amostra e da integridade da parede celular não sejam comprometidas após a fixação e a desidratação subsequente. Meristemas florais jovens são particularmente vulneráveis ao colapso da parede celular (Figuras 1a, 1b). Da mesma forma, as estruturas delicadas como nectáreos, pétalas, estigmas e sporangia exigem protocolos eficazes e undamaging. Esta revisão resume um protocolo ideal para manter os tecidos jovens e delicadas intactas para geração de imagens SEM.
No caso dos oomicetos (Stramenopiles) -um dos grupos mais diversos e generalizadas de parasitas, com hospedeiros que variam de micróbios e plantas para os invertebrados e vertebrados 37 – há esporos que crescem e se desenvolvem em um ambiente úmido. Esta condição representa um desafio para a observação SEM, porque os esporos precisam de um substrato adequado não é adequado para protocolos SEM padrão. Entre os oomicetos, espécies de Saprolegnia são de particular interesse porque eles can causar reduções graves no aquacultura, pesca e populações de anfíbios 38. Características micromorfológicas, como os espinhos em forma de gancho de cistos, foram encontrados para ser útil para identificar espécies de Saprolegnia, que é fundamental para estabelecer controles de infecção e tratamentos potenciais 39. Aqui, existe um protocolo experimental para comparar os padrões do crescimento da coluna de cistos em substratos diferentes e para manipular a amostra para a preparação crítica secador de ponto (CPD) e subsequente observação SEM.
Em um terceiro caso, há descobertas interessantes que surgiram depois de uma inspecção dos esporos dos fungos Phellorinia herculanea f. f stellata. nova (Agaricales) 31. Juntamente com os esporos, um grupo de células berçário inesperados foi identificado sob o SEM. Com protocolos tradicionais anteriores e de matérias não tratadas, as células enfermeira veio UOt desmoronou completamente (Figura 1c). Mais inferências sobre tecidos específicos associados aos esporos podem ser feitas com as modificações simples, mas cruciais para as abordagens padrão descritos aqui (Figura 1D).
Nesta revisão, há protocolos detalhados SEM que podem ser usados para lidar com diferentes problemas associados com a observação SEM em angiospermas, oomycetes e Agaricales, tais como o colapso celular e encolhimento tecido meristemático, o crescimento não-ideal de espinhos cisto, e destruição de tecidos efêmeras, respectivamente.
Figura 1: Comparação das amostras tratadas sem (A, C) e com (b, d) o protocolo FAA-etanol-CPD. (A – b) Os botões florais do Anacyclus Clavatus, mid-desenvolvimento. Bud tratada com tetróxido de ósmio 46 </ sup> (a) e Bud tratados com o protocolo FAA-CPD (b). (C – d) células enfermeira com esporos de Phellorinia herculanea f. stellata. As amostras secas, sem qualquer tratamento (C) e com o protocolo aqui descrito para Agaricales (d). Esporos em laranja. Escalas: (AB) 100 uM, (CD) de 50 um. Fotos foram tiradas por Y. Ruiz-León. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.
Protocol
Representative Results
Discussion
No que diz respeito aos protocolos SEM padrão, os procedimentos aqui apresentados incluem relativamente rápida, fácil de seguir, e metodologias de baixo custo. Dependendo da quantidade de amostras e na facilidade de processamento, que leva quatro a cinco dias para adquirir imagens de boa qualidade. Incluindo as precauções de segurança adequadas para a CPD e operação SEM, os procedimentos são fáceis de manusear. Um cuidado especial deve ser tomado com formalina e o glutaraldeído (consulte os passos 1.1.1 a 1.1…
Divulgations
The authors have nothing to disclose.
Acknowledgements
Este projecto recebeu financiamento do programa de pesquisa e inovação Horizonte 2020 da União Europeia ao abrigo do acordo de subvenção No. 634429. Esta publicação reflecte apenas as opiniões do autor, ea Comissão Europeia não pode ser responsabilizada por qualquer uso que possa ser dado à informação nele contidas. Nós também reconhecemos a contribuição financeira do real Jardín Botánico, CSIC. SR é grato à União Europeia [ITN-SAPRO-238550] pelo apoio de sua pesquisa em Saprolegnia. Também quero agradecer a Francisco Calonge por gentilmente fornecer as imagens herculanea Phellorinia e B. Pueyo para o processamento de amostras (Figura 5). Todas as imagens foram tiradas pelo serviço de SEM no Real Jardín Botánico-CSIC em Madrid.
Materials
| Acetic acid | No specific supplier | Skin irritation, eye irritation | |
| aluminium stubs | Ted Pella, Inc. | 16221 | www.tedpella.com |
| Centrifuge tubes | No specific supplier | ||
| Critical Point Dryer | Polaron Quatum Technologies | CPD7501 | |
| D (+) Glucose | Merck | 1,083,421,000 | |
| Double sided sellotape | No specific supplier | ||
| Ethanol absolute | No specific supplier. | Flammable | |
| European bacteriological agar | Conda | 1800.00 | www.condalab.com |
| Filter paper | No specific supplier | ||
| Forceps | No specific supplier | ||
| Formalin 4% | No specific supplier. | Harmful, acute toxicity, skin sensitisation, carcinogenicity. Flammable | |
| Glass cover slips | No specific supplier | ||
| Glass hermetic container | No specific supplier | ||
| Glutaraldehyde 25% DC 253857.1611 (L) | Dismadel S.L. | 3336 | www.dismadel.com |
| Mycological peptone | Conda | 1922.00 | www.condalab.com |
| needles | No specific supplier | ||
| Petri dishes | No specific supplier | ||
| Plastic containers | No specific supplier | ||
| Sample holder with lid for the critical point dryer | Ted Pella, Inc. | 4591 | www.tedpella.com |
| scalpels | No specific supplier | ||
| Scanning Electron Microscope | Hitachi | S3000N | |
| Software for SEM | |||
| Solution A: NaH2PO4 | |||
| Solution B: Na2HPO4 | |||
| Specimen holders | No specific supplier | ||
| Sputter coater | Balzers | SCD 004 | |
| Stereomicroscope | No specific supplier | ||
| Transmission Electron Microscope (TEM) grids | Electron Microscopy Sciences | G200 (Square Mesh) | www.emsdiassum.com |
| Tweezers | No specific supplier |
References
- Endress, P. K., Baas, P., Gregory, M. Systematic plant morphology and anatomy: 50 years of progress. Taxon. 49 (3), 401-434 (2000).
- Falk, R. H., Gifford, E. M., Cutter, E. G. Scanning electron microscopy of developing plant organs. Science. 168 (3938), 1471-1474 (1970).
- Damblon, F. Sputtering, a new method of coating pollen grains in scanning electron microscopy. Grana. 15 (3), 137-144 (1975).
- Everhart, T. E., Thornley, R. F. M. Wide-band detector for micro-microampere low-energy electron currents. J. Sci. Instrum. 37 (7), 37246-37248 (1960).
- Collins, S. P., et al. Advantages of environmental scanning electron microscopy in studies of microorganisms. Microsc. Res. Techniq. 25 (5-6), 398-405 (1993).
- Fannes, W., Vanhove, M. P. M., Huyse, T., Paladini, G. A scanning electron microscope technique for studying the sclerites of Cichlidogyrus. Parasitol. Res. 114 (5), 2031-2034 (2015).
- Erbar, C., Leins, P. Portioned pollen release and the syndromes of secondary pollen presentation in the Campanulales-Asterales complex. Flora. 190 (4), 323-338 (1995).
- Jansen, S., Smets, E., Baas, P. Vestures in woody plants: a review. IAWA Journal. 19 (4), 347-382 (1998).
- Bortolin Costa, M. F., et al. Stigma diversity in tropical legumes with considerations on stigma classification. Bot. Rev. 80 (1), 1-29 (2014).
- Almeida, O. J. G., Cota-Sánchez, J. H., Paoli, A. A. S. The systematic significance of floral morphology, nectaries, and nectar concentration in epiphytic cacti of tribes Hylocereeae and Rhipsalideae (Cactaceae). Perspect. Plant Ecol. 15 (5), 255-268 (2013).
- Konarska, A. Comparison of the structure of floral nectaries in two Euonymus L. species (Celastraceae). Protoplasma. 252 (3), 901-910 (2015).
- Giuliani, C., Maleci Bini, L. Insight into the structure and chemistry of glandular trichomes of Labiatae, with emphasis on subfamily Lamioideae. Plant Syst. Evol. 276 (3-4), 199-208 (2008).
- Li, K., Zheng, B., Wang, Y., Zhou, L. L.Breeding system and pollination biology of Paeonia delavayi (Paeoniaceae), an endangered plant in the Southwest of China. Pak. J. Bot. 46 (5), 1631-1642 (2014).
- García, L., Rivero, M., Droppelmann, F. Descripción morfológica y viabilidad del polen de Nothofagus nervosa (Nothofagaceae). Bosque. 36 (3), 487-496 (2015).
- Prenner, G., Klitgaard, B. B. Towards unlocking the deep nodes of Leguminosae: floral development and morphology of the enigmatic Duparquetia orchidacea (Leguminosae, Caesalpinioideae). Am. J. Bot. 95 (11), 1349-1365 (2008).
- Ratnayake, K., Joyce, D. C., Webb, R. I. A convenient sample preparation protocol for scanning electron microscope examination of xylem-occluding bacterial biofilm on cut flowers and foliage. Sci. Hortic-Amsterdam. 140 (1), 12-18 (2012).
- Çolak, G., Celalettin Baykul, M., Gürler, R., Çatak, E., Caner, N. Investigation of the effects of aluminium stress on some macro and micro-nutrient contents of the seedlings of Lycopersicon esculentum Mill. by using scanning electron microscope. Pak. J. Bot. 46 (1), 147-160 (2014).
- Arafa, S. Z. Scanning electron microscope observations on the monogenean parasite Paraquadriacanthus nasalis from the nasal cavities of the freshwater fish Clarias gariepinus in Egypt with a note on some surface features of its microhabitat. Parasitol. Res. 110 (5), 1687-1693 (2012).
- Uppalapatia, S. R., Kerwinb, J. L., Fujitac, Y. Epifluorescence and scanning electron microscopy of host-pathogen interactions between Pythium porphyrae (Peronosporales, Oomycota)and Porphyra yezoensis (Bangiales, Rhodophyta). Bot. Mar. 44 (2), 139-145 (2001).
- Meaney, M., Haughey, S., Brennan, G. P., Fairweather, I. A scanning electron microscope study on the route of entry of clorsulon into the liver fluke, Fasciola hepatica. Parasitol. Res. 95 (2), 117-128 (2005).
- Sundarasekar, J., Sahgal, G., Subramaniam, S. Anti-candida activity by Hymenocallis littoralis extracts for opportunistic oral and genital infection Candida albicans. Bangladesh J. Pharmacol. 7 (3), 211-216 (2012).
- Benhamou, N., Rey, P., Picard, K., Tirilly, Y. Ultrastructural and cytochemical aspects of the interaction between the mycoparasite Pythium oligandrum and soilborne plant pathogens. Phytopathology. 89 (6), 506-517 (1999).
- Singh, A., et al. First evidence of putrescine involvement in mitigating the floral malformation in mangoes: A scanning electron microscope study. Protoplasma. 251 (5), 1255-1261 (2014).
- Xiang, C., et al. Fine mapping of a palea defective 1 (pd1), a locus associated with palea and stamen development in rice. Plant Cell Rep. 34 (12), 2151-2159 (2015).
- Mendoza, L., Hernandez, F., Ajello, L. Life cycle of the human and animal oomycete pathogen Pythium insidiosum. J. Clin. Microbiol. 31 (11), 2967-2973 (1993).
- Bello, M. A., Rudall, P. J., González, F., Fernández, J. L. Floral morphology and development in Aragoa (Plantaginaceae) andrelated members of the order Lamiales. Int. J. Plant Sci. 165 (5), 723-738 (2004).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral morphology and development in Quillajaceae and Surianaceae (Fabales), the species-poor relatives of Leguminosae and Polygalaceae. Ann. Bot. 100 (4), 1491-1505 (2007).
- Bello, M. A., Hawkins, J. A., Rudall, P. J. Floral ontogeny in Polygalaceae and its bearing on the homologies of keeled flowers in Fabales. Int. J. Plant Sci. 171 (5), 482-498 (2010).
- Bello, M. A., Alvarez, I., Torices, R., Fuertes-Aguilar, J. Floral development and evolution of capitulum structure in Anacyclus (Anthemideae, Asteraceae). Ann. Bot. 112 (8), 1597-1612 (2013).
- Bello, M. A., Martínez-Asperilla, A., Fuertes-Aguilar, J. Floral development of Lavatera trimestris and Malva hispanica reveals the nature of the epicalyx in the Malva generic alliance. Bot. J. Linn. Soc. 181 (1), 84-98 (2016).
- Calonge, F. D., Martínez, A. J., Falcó, I., Samper, L. E. Phellorinia herculanea f. stellata f. nova encontrada en España. Bol. Soc. Micol.Madrid. 35 (1), 65-70 (2011).
- Liu, Y., et al. Deciphering microbial landscapes of fish eggs to mitigate emerging diseases. ISME J. 8 (10), 2002-2014 (2014).
- Sandoval-Sierra, J. V., Diéguez-Uribeondo, J. A comprehensive protocol for improving the description of Saprolegniales (Oomycota): two practical examples (Saprolegnia aenigmatica sp. nov. and Saprolegnia racemosa sp. nov.). PLOS one. , (2015).
- Endress, P. K. Zur vergleichenden Entwicklungsmorphologie, Embryologie und Systematik bei Laurales. Bot. Jahrb. Syst. 92 (2), 331-428 (1972).
- Tucker, S. Floral development in Saururus cernuus (Saururaceae):1. Floral initiation and stamen development. Am. J. Bot. 62 (3), 993-1005 (1975).
- Endress, P. K., Matthews, M. L. Progress and problems in the assessment of flower morphology in higher-level systematics. Plant Syst. Evol. 298 (2), 257-276 (2012).
- Beakes, G. W., Glockling, S. L., Sekimoto, S. The evolutionary phylogeny of the oomycete "fungi". Protoplasma. 249 (1), 3-19 (2012).
- Romansic, J. M., et al. Effects of the pathogenic water mold Saprolegnia ferax on survival of amphibian larvae. Dis. Aquat. Organ. 83 (3), 187-193 (2009).
- van West, P. Saprolegnia parasitica, an oomycete pathogen with a fishy appetite: new challengues for an old problem. Mycologist. 20 (3), 99-104 (2006).
- Johansen, D. A. . Plant microtechnique. , (1940).
- Unestam, T. Studies on the crayfish plague fungus Aphanomyces astaci. Some factors affecting growth in vitro. Physiol. Plantarum. 18 (2), 483-505 (1965).
- Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence from isolated spore cysts of Aphanomyces astaci. Exp. Mycol. 8 (4), 370-377 (1984).
- Diéguez-Uribeondo, J., Cerenius, L., Söderhäll, K. Repeated zoospore emergence in Saprolegnia parasitica. Mycol. Res. 98 (7), 810-815 (1994).
- Söderhäll, K., Svensson, E., Unestam, T. Chitinase and protease activities in germinating zoospore cysts of a parasitic fungus, Aphanomyces astaci, Oomycetes. Mycopathologia. 64 (1), 9-11 (1978).
- Echlin, P. . Handbook of sample preparation for scanning electron microscopy and X-Ray Microanalysis. , (2009).
- Osumi, M., et al. Preparation for observation of fine structure of biological specimens by high-resolution SEM. Microscopy. 32 (4), 321-330 (1983).
- Rezinciuc, S. . The Saprolegniales morpho-molecular puzzle: an insight into markers identifying specific and subspecific levels in main parasites. , (2013).
